COVID-19表現(xiàn)出不同的疾病嚴(yán)重程度和癥狀，包括急性全身性炎癥和高細(xì)胞因子血癥，隨后出現(xiàn)免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)異常。COVID-19中的細(xì)菌重復(fù)感染可使病程進(jìn)一步復(fù)雜化，并與死亡率增加有關(guān)。然而，人們對SARS-CoV-2的發(fā)病機(jī)制和高細(xì)胞因子血癥如何阻礙對抗細(xì)菌重復(fù)感染的先天免疫功能的了解有限。因此，研究者評估了COVID-19急性期患者和相應(yīng)恢復(fù)期患者的COVID-19血漿高細(xì)胞因子血癥對髓系免疫細(xì)胞對細(xì)菌挑戰(zhàn)的功能反應(yīng)的影響。研究者發(fā)現(xiàn)COVID-19患者嚴(yán)重的高細(xì)胞因子狀態(tài)與細(xì)菌重復(fù)感染的發(fā)展相關(guān)。接受地塞米松治療的COVID-19患者血漿中總體炎癥標(biāo)志物顯著降低，并對體外細(xì)菌挑戰(zhàn)表現(xiàn)出增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。最后，廣泛的抗炎治療與COVID-19危重患者CRP、IL-6水平以及ICU住院時(shí)間和通氣天數(shù)的降低有關(guān)。

01研究思路

1. COVID -19介導(dǎo)的高細(xì)胞因子血癥與隨后的細(xì)菌重復(fù)感染相關(guān)

研究者試圖調(diào)查在ICU住院期間發(fā)生繼發(fā)性細(xì)菌感染(細(xì)菌重復(fù)感染)的COVID-19患者與未發(fā)生細(xì)菌重復(fù)感染的患者的細(xì)胞因子水平是否存在差異。主成分分析(PCA)顯示，在COVID-19患者急性期和rec期測量的細(xì)胞因子與健康供體分開聚集(圖1A)。發(fā)生細(xì)菌重復(fù)感染的急性期(圖1B)和rec期COVID-19患者(圖1C)與未發(fā)生細(xì)菌重復(fù)感染的患者(圖1A-1C)相比，其密度曲線上的分離度均有所增加。發(fā)生細(xì)菌重復(fù)感染的患者在急性期和rec期均表現(xiàn)出顯著升高的累積細(xì)胞因子水平(炎癥指數(shù))(圖1D)。

圖1 COVID-19血漿中炎癥介質(zhì)的特征及其與細(xì)菌重復(fù)感染的關(guān)系

2、急性期COVID-19患者中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞對細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的清除減少

研究者進(jìn)一步評估了體外細(xì)菌挑戰(zhàn)時(shí)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的功能。在用肺炎鏈球菌(SP)或金黃色葡萄球菌(SA)進(jìn)行細(xì)菌感染之前，先用自體或異源血漿培養(yǎng)來自COVID-19危重患者或健康供體的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞(圖2A-2D)。研究者觀察到，與健康血漿刺激相比，來自COVID-19患者或健康捐贈者的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞與急性期COVID-19血漿孵育后，細(xì)胞內(nèi)殺菌功能受損，清除細(xì)菌的能力顯著降低(圖2A-2D)。

圖2 急性期COVID-19患者先天性免疫細(xì)胞胞內(nèi)殺菌能力受損

3、急性期COVID-19患者對細(xì)菌挑戰(zhàn)的中性粒細(xì)胞效應(yīng)反應(yīng)受損

接下來研究者評估了與急性期COVID-19中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)殺傷能力降低有關(guān)的因素，研究者分析了關(guān)鍵的中性粒細(xì)胞效應(yīng)反應(yīng)。用急性期COVID-19血漿刺激急性期患者或健康供體的中性粒細(xì)胞，與用健康血漿刺激相比，細(xì)菌攻擊時(shí)ROS水平顯著降低(圖3A)，髓過氧化物酶(MPO)水平顯著降低(圖3C(左))。急性期患者的中性粒細(xì)胞比來自rec期患者或健康供體的中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出更高數(shù)量的自發(fā)細(xì)胞外DNA釋放(圖4A(上))和更高水平的MPO-DNA復(fù)合物(圖4A(下))。然而，與rec期患者或健康供體的中性粒細(xì)胞相比，細(xì)菌攻擊導(dǎo)致急性期患者中性粒細(xì)胞中細(xì)胞外陷阱(NETs)和MPO-DNA復(fù)合物的釋放顯著降低(圖4B-4D)。

圖3 急性COVID-19患者對細(xì)菌挑戰(zhàn)的中性粒細(xì)胞效應(yīng)反應(yīng)受損

圖4 在繼發(fā)性細(xì)菌挑戰(zhàn)時(shí)，COVID-19患者中NETs受損

4、急性期COVID-19患者的中性粒細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變進(jìn)一步表征了功能障礙的表型

鑒于觀察到急性期COVID-19患者的中性粒細(xì)胞效應(yīng)反應(yīng)受損，研究者研究了中性粒細(xì)胞潛在的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)機(jī)制和受體表型。急性期患者的中性粒細(xì)胞趨化因子受體CXCR2、CXCR3和CCR5的表達(dá)明顯降低(圖5B和5F)。此外，研究者觀察到急性期患者中性粒細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD66b水平較高(圖5C)。在細(xì)菌感染后，在急性期COVID-19患者的中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了類似的細(xì)胞表面受體表型模式(圖5A-5F)?？傮w而言，COVID-19急性期患者的PCA與rec期患者和健康供體明顯分離，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的受體表型聚類，而rec期和健康對照組在很大程度上重疊(圖5G-5I)。最后，研究者研究了COVID-19患者中這種獨(dú)特的中性粒細(xì)胞表型是否也以細(xì)菌攻擊時(shí)參與自分泌-旁分泌信號傳導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生受損為特征。具體結(jié)果見圖5J-5K。

圖5 中性粒細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌

5、COVID-19中單核細(xì)胞亞群信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變表征了抗菌表型受損

急性期患者的經(jīng)典單核細(xì)胞表現(xiàn)出更多的異質(zhì)性，與恢復(fù)期和健康期單核細(xì)胞相比，CD163、CX3CR1表達(dá)較高，HLA-DR表達(dá)較低(圖6A)。細(xì)菌攻毒后，來自COVID-19患者(急性期和rec期)的經(jīng)典單核細(xì)胞顯示CD163和CD11b高表達(dá)，但激活標(biāo)志物HLA-DR、CD86和CD80低表達(dá)(圖6A -6D)?？偟膩碚f，經(jīng)典單核細(xì)胞的PCA在細(xì)菌攻擊時(shí)顯示出急性期COVID-19聚集模式，這與HLA-DR、CD86、CD80低表達(dá)和CD163、CX3CR1和CD11b高表達(dá)密切相關(guān)(圖6G-6I)。最后，與健康對照組相比，細(xì)菌攻擊時(shí)COVID-19單核細(xì)胞顯示細(xì)胞因子分泌抑制(圖6J和6K)。

圖6 細(xì)菌攻擊時(shí)單核細(xì)胞表面標(biāo)記物和分泌細(xì)胞因子的表型特征

6、TNF-α、IFN-γ和IL-4聯(lián)合抑制COVID-19危重患者髓系免疫細(xì)胞抗菌效應(yīng)功能受損

研究者比較了2020年3月至6月第一波危重患者的血漿細(xì)胞因子水平與2020年7月至12月第二波危重患者的血漿細(xì)胞因子水平，并按是否存在細(xì)菌重復(fù)感染情況進(jìn)行分層。根據(jù)恢復(fù)試驗(yàn)，地塞米松治療是在第二波治療期間進(jìn)行的。細(xì)胞因子的PCA值顯示急性期或rec期患者之間以及細(xì)菌重復(fù)感染狀態(tài)之間有明顯的區(qū)別(圖7A)。此外，對于在ICU住院期間出現(xiàn)細(xì)菌重復(fù)感染的COVID-19危重患者，在PCA中觀察到細(xì)胞因子的清晰聚類(圖7B)。為了研究這種特定細(xì)胞因子簇在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞功能反應(yīng)能力重疊感染患者中的潛在作用，研究者使用細(xì)菌攻擊前的單個(gè)細(xì)胞因子或細(xì)胞因子組合對健康供體中性粒細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子刺激試驗(yàn)。他們發(fā)現(xiàn)了五種細(xì)胞因子的強(qiáng)烈作用，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌存活增加(圖7D)。當(dāng)不同的細(xì)胞因子組合刺激細(xì)胞時(shí)，這種表型顯著增加。具體結(jié)果見圖7E-G。最后，研究者確認(rèn)了這些已確定的細(xì)胞因子在觀察到的COVID-19髓系免疫細(xì)胞抗菌效應(yīng)功能受損中的重要性：TNF-α、IFN-γ或IL-4受體的阻斷會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌存活率降低，而TNF-α和IFN-γ或TNF-α、IFN-γ和IL-4受體的阻斷會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌存活率顯著降低(圖7H)。

圖7 根據(jù)重復(fù)感染狀態(tài)和功能性細(xì)胞因子分析定量COVID-19患者血漿細(xì)胞因子水平

7、血漿蛋白質(zhì)組學(xué)顯示，在接受地塞米松治療的COVID-19危重患者中，炎癥介質(zhì)減少

除了分析COVID-19急性期和rec期的血漿細(xì)胞因子水平外，研究者還試圖確定血漿中是否有其他可溶性蛋白可能是骨髓免疫細(xì)胞抗菌效應(yīng)反應(yīng)受損的驅(qū)動因素。研究者通過TIMS-TOF-MS對這些患者血漿中的蛋白質(zhì)變化進(jìn)行了評估。他們在33份血漿樣本中共鑒定出308種蛋白質(zhì)，包括16對患者(急性期和rec期)，其中8對來自第1波(未接受地塞米松治療)和第2波(接受地塞米松治療)的COVID-19危重患者，外加第1波(未配對)的急性期患者樣本?；鹕綀D顯示，與rec期相比，急性期第1波中涉及組織保護(hù)的蛋白質(zhì)，如SERPINA10、炎癥標(biāo)志物CRP、LBP、TSKU、SAA2和S100A9以及髓系免疫細(xì)胞標(biāo)志物CD14增加了兩倍以上(圖8A)。對于第2波，僅在FDR為0.25時(shí)觀察到蛋白強(qiáng)度的差異，與波1相比，急性期和rec期的蛋白強(qiáng)度差異要小得多，但SAA2和S100A9的水平也較高(圖8B)。此外，根據(jù)患者的病情(急性期vs rec期)，對波1和波2患者中蛋白質(zhì)的顯著強(qiáng)度變化進(jìn)行評估，結(jié)果顯示，與波2相比，波1中CD14、HPR、MNDA和幾種SERPINAs等蛋白質(zhì)的倍數(shù)變化顯著更高(圖8C)，表明波1和波2中炎癥介質(zhì)水平存在顯著差異。對于兩波患者受影響的不同途徑，他們通過Reactome (Reactome數(shù)據(jù)庫)基因集富集分析(GSEA)觀察到，與波1和波2之間的rec期相比，急性期的幾個(gè)代謝過程明顯失調(diào)(圖8D和8E)，特別是在先天免疫防御和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中。最后，他們進(jìn)行了STRING相互作用分析：由于它們參與先天免疫反應(yīng)、對細(xì)菌的防御反應(yīng)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和髓系細(xì)胞的激活以及對感染的免疫效應(yīng)反應(yīng)的調(diào)節(jié)，大量已鑒定的蛋白質(zhì)緊密相連(圖8G)。

圖8 COVID-19急性期患者血漿蛋白譜的評估及其相應(yīng)的rec期

8、改善骨髓細(xì)胞對細(xì)菌挑戰(zhàn)的效應(yīng)反應(yīng)和降低炎癥介質(zhì)水平與地塞米松治療有關(guān)

研究者使用健康供體中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞與第1波或第2波患者的血漿進(jìn)行刺激試驗(yàn)，并評估其對細(xì)菌挑戰(zhàn)的效應(yīng)反應(yīng)。結(jié)果顯示，與健康血漿刺激相比，波1血漿刺激的中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌存活顯著增加(圖9A)， ROS水平降低(圖9B)，細(xì)胞死亡增強(qiáng)(圖9C)，而波2血漿刺激沒有觀察到這些差異。一項(xiàng)對第一波發(fā)生細(xì)菌重復(fù)感染的COVID-19患者的分析顯示，在急性期和rec期，通過細(xì)胞因子總結(jié)評分(炎癥指數(shù))測量的累積細(xì)胞因子水平顯著升高(圖1D和9D)。此外，與第一波相比，在第二波中，菌血癥患者血漿中的細(xì)胞因子總結(jié)評分顯著降低(圖9E，左)，且在肺部重復(fù)感染患者中呈下降趨勢(圖9E，右)。

圖9 與第一波和第二波COVID-19相比，血漿中炎癥介質(zhì)的定量及其與細(xì)菌重復(fù)感染的關(guān)系

02主要結(jié)論

研究者證明了在急性COVID-19期間，重癥患者出現(xiàn)了中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞因子的改變，這嚴(yán)重影響了他們應(yīng)對細(xì)菌挑戰(zhàn)的能力，這是通過對中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)行深入的功能和表型評估確定的。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了臨床病程，與第2波相比，第1波重癥COVID-19患者的細(xì)菌重復(fù)感染增加。他們的研究進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了針對性治療的重要性，旨在恢復(fù)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的抗菌效應(yīng)功能，從而降低COVID-19因繼發(fā)性細(xì)菌感染導(dǎo)致死亡率升高的風(fēng)險(xiǎn)。

審核編輯 ：李倩