2023年2月3日，華中科技大學(xué)費鵬團隊在Cell子刊STAR Protocols雜志上發(fā)表了題為“A practical guide to deep-learning light-field microscopy for 3D imaging of biological dynamics”的實驗方案文章。該文章提供了深度學(xué)習(xí)增強光場顯微鏡的實施步驟，其中包括簡單易實施的光場顯微鏡搭建步驟和用戶友好的軟件包及其詳細的操作說明。

觀測高度動態(tài)的生物學(xué)過程對生命科學(xué)研究具有極大的意義，例如心臟跳動、血液流動和神經(jīng)活動。這些過程經(jīng)常發(fā)生在單個細胞級別的三維空間尺度和毫秒級時間尺度。因此，如何快速而準(zhǔn)確地捕捉這些三維空間中的動態(tài)變化信息，以揭示信號的時空演變規(guī)律和背后的生物學(xué)機制，是一個非常重要的挑戰(zhàn)。然而，目前主流的三維熒光顯微成像技術(shù)，如掃描共聚焦顯微鏡和光片顯微鏡等高分辨掃描顯微鏡，由于受到激發(fā)光子數(shù)量的限制，其成像速度通常被限制在秒到分鐘級。而常規(guī)的光場顯微鏡需要通過犧牲空間分辨率來換取高時間分辨率，這使得它們難以觀察到上述三維動態(tài)生物學(xué)過程的變化。

針對上述問題，該文章系統(tǒng)地介紹了費鵬團隊首創(chuàng)提出的一種深度學(xué)習(xí)光場顯微鏡的實驗方案。該方案結(jié)合了高速的光場熒光顯微鏡和基于深度學(xué)習(xí)的光場重建算法，能夠以單細胞分辨率對毫秒級動態(tài)生物學(xué)過程進行百赫茲幀率的三維成像。該方法高時空分辨率的三維成像能力為很多重要生物學(xué)應(yīng)用提供了可能，例如行為相關(guān)的神經(jīng)活動以及模型生物的心血管血液動力學(xué)等。

實施深度學(xué)習(xí)光場顯微鏡的步驟包括：搭建光場顯微鏡并用其進行三維熒光信號的高速采集；進行基于深度學(xué)習(xí)的光場三維重建算法的數(shù)據(jù)處理和模型訓(xùn)練；用訓(xùn)練好的網(wǎng)絡(luò)對采集到的時序動態(tài)光場信號進行三維重建（圖1）。最后本方案以線蟲和斑馬魚這兩類典型模式生物為例，提供了自由運動線蟲神經(jīng)元和斑馬魚心跳血流的成像流程，并且基于重建結(jié)果展示了對線蟲神經(jīng)活動和斑馬魚心血管血液動力學(xué)的定量分析流程。

圖1 深度學(xué)習(xí)增強光場顯微鏡的實施步驟

本文提供的光場成像系統(tǒng)搭建方案是便于用戶實施的簡單易操作的（圖2）。該方案基于常規(guī)商用寬場顯微鏡設(shè)計，便于用戶進行樣品的固定和操作。其中所有光學(xué)和光機械件都是易于購買的，并采用了簡單易操作的籠式系統(tǒng)。

圖2 光場顯微鏡原理及樣機示意圖

另外，為了保證用戶能以最高效的方式達到最優(yōu)的三維重建結(jié)果，文章中還基于配套的軟件包以及實例教程，提供了一套針對光場三維重建網(wǎng)絡(luò)的特定數(shù)據(jù)處理以及網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練流程。其中包括便于構(gòu)建訓(xùn)練數(shù)據(jù)的光場投影算法、適用于不同成像需求的多種推薦的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)。

最后以線蟲和斑馬魚這兩類典型模式生物為例，詳述了研究自由運動線蟲神經(jīng)元活動和活體斑馬魚心臟血流動力學(xué)兩個具體生物應(yīng)用的數(shù)據(jù)采集和定量分析流程，實例結(jié)果如圖3所示。

圖3 深度學(xué)習(xí)光場顯微鏡用于自由運動線蟲神經(jīng)元活動和跳動斑馬魚心臟的血流動力學(xué)研究

審核編輯：劉清