圖 1：使用分光器的多焦點平面顯微鏡。樣本中的兩個不同焦平面(一紅一藍(lán))由50:50分光器分割。反射光(藍(lán)色)被發(fā)送到相機(jī)1，而透射光(紅色)被發(fā)送到相機(jī)2。通過這種方式，可以同時對兩個不同的焦平面進(jìn)行成像?；蛘撸梢允褂冒l(fā)射圖像分離器通過一個檢測器對兩個焦平面進(jìn)行成像。

介紹

分光器是一種將光(例如激光束)分成兩束(或多束)的光學(xué)裝置。分光器在顯微鏡中非常有用，因為它們可以充當(dāng)顯微鏡和探測器/相機(jī)之間的接口，分離顯微鏡的發(fā)射光。

分光器有兩種主要類型：發(fā)射圖像分光器將光分到單個相機(jī)傳感器上，以便一臺相機(jī)可以同時對多個波長進(jìn)行成像;多相機(jī)適配器將光分到多個相機(jī)上，從而允許一個樣品同時成像多個相機(jī)。這兩種分光器裝置本質(zhì)上都允許在多個波長、偏振狀態(tài)或振幅下同時對樣品進(jìn)行成像。有關(guān)分離器的介紹，請參閱我們的技術(shù)說明：“分離器簡介”。

本文將介紹如何使用此類分光器設(shè)備來增強(qiáng)顯微鏡技術(shù)和高級成像應(yīng)用。為什么要使用分離器?

需要分離器的技術(shù)

分光器允許同時對不同狀態(tài)進(jìn)行成像：無需手動或使用電子開關(guān)調(diào)整顯微鏡設(shè)置，而是可以無延遲地光學(xué)獲取兩種狀態(tài)。多焦平面顯微鏡 (MPM)是這對于成像應(yīng)用有用的一個示例，如圖 1所示。 MPM 涉及同時對同一樣本的兩個不同焦平面進(jìn)行成像，而不是手動調(diào)整焦點，然后在不同的所需焦平面處拍攝圖像。

如果對 2D 細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行成像，一個焦平面通常就足夠了，因為大多數(shù)細(xì)胞制劑都不是很厚。但隨著越來越多的研究人員開始對更大的 3D 樣本進(jìn)行成像，MPM 提供了一種有用的方法，可以在細(xì)胞在 3D 支架中相互作用或較大的生物體進(jìn)行動態(tài)運動時對多個所需焦平面進(jìn)行成像。對實時 3D 樣品進(jìn)行成像時，高速是必要的，并且由于無需手動調(diào)整焦點，MPM 提供了一種高速選項，可同時對穿過樣品的多個 z 平面進(jìn)行成像。 MPM 的實際應(yīng)用示例如圖 2所示。

圖 2：高速 MPM 可視化活體游泳的布氏錐蟲寄生蟲。該實驗使用了四路發(fā)射圖像分離器 MultiSplit V2。A) 同一樣本的四個獨立圖像通道，每個圖像通道在不同的焦平面處拍攝。 B) 對四個獨立的焦平面進(jìn)行著色、組合和過濾。每種顏色都來自不同的焦平面。 C) 四個焦平面相互關(guān)系的直接可視化。圖片改編自惠勒 (2019)。

如果沒有分光器，等待樣品移動到正確位置時可能會浪費時間，例如選擇性平面照明顯微鏡 (SPIM) 等光片技術(shù)中的掃描。掃描還會因相機(jī)快門而產(chǎn)生拖尾效應(yīng)，并限制可用的曝光時間。通過同時捕捉多個興趣點，可以避免這些限制，從而可以捕捉 3D 空間中微小、微弱和快速移動的物體。如果沒有分光器，MPM 就不可能實現(xiàn)，并且展示了操縱樣品發(fā)射光的強(qiáng)大功能和靈活性。

另一種需要分光器的技術(shù)是同時 多探針熒光成像，涉及不同熒光探針的同時成像。絕大多數(shù)熒光顯微鏡使用多個熒光團(tuán)，特別是在藍(lán)色通道通常被 DAPI(一種易于使用的細(xì)胞核標(biāo)記物)占據(jù)的細(xì)胞上，為標(biāo)記特定蛋白質(zhì)的其他熒光團(tuán)留下紅色和綠色通道。

顯微鏡通常有一個電子開關(guān)，以便這些不同的熒光團(tuán)可以在不同的通道中成像，從而產(chǎn)生多通道圖像。切換時仍然存在時間延遲，并且使用分光器可以選擇同時對多個熒光波長進(jìn)行成像，從而消除任何延遲。這在對活細(xì)胞進(jìn)行熒光成像時特別有用，可以高速捕獲快速動態(tài)事件。除了結(jié)合熒光探針外，微分干涉對比 (DIC) 等明場圖像也可以與熒光圖像結(jié)合。

圖 3：多探針熒光成像。頂部圖像顯示兩個獨立的熒光通道(綠色和紅色)，以及可以通過使用分光器同時成像來實現(xiàn)的組合圖像。該圖像可以通過后處理生成，但時間和信息可能會丟失。底部圖像分別顯示明場圖像 (DIC) 和兩個熒光標(biāo)記物(黃色熒光蛋白 YFP 和 DAPI)，以及三者的組合。

分離器增強(qiáng)的技術(shù)

有些技術(shù)本質(zhì)上并不需要分離器來發(fā)揮作用，但它的包含使人受益匪淺。這主要是由于能夠同時對多個不同狀態(tài)進(jìn)行成像，從而節(jié)省時間，并且根據(jù)技術(shù)的不同，其他優(yōu)點也有所不同。值得注意的是，幾乎所有先進(jìn)的顯微鏡應(yīng)用都受益于分光器和更靈活的成像能力，因此這里提到的技術(shù)只是冰山一角，本文絕不是詳盡無遺的。

其中一項技術(shù)是福斯特共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)，這是一種用于確定兩個熒光團(tuán)彼此是否在一定距離內(nèi)的技術(shù)。 FRET 利用熒光團(tuán)分子之間的能量轉(zhuǎn)移原理：類似于兩個磁鐵只有在足夠靠近時才會吸引，兩個熒光團(tuán)只有在彼此距離在1-10 nm 以內(nèi)時才會交換能量。 FRET 中有兩種熒光分子：供體和受體，如果供體被激發(fā)并移動到足夠靠近受體，它將轉(zhuǎn)移能量。隨后供體熒光的減少和受體熒光的增加可以通過顯微鏡輕松檢測到。這本質(zhì)上使 FRET 成為一種可以測量分子之間距離的“光譜尺”，因為只有當(dāng)熒光團(tuán)彼此之間的距離在 10 nm 以內(nèi)時才會發(fā)生反應(yīng)。

由于有兩個熒光團(tuán)，用于激發(fā)它們的光應(yīng)該具有不同的波長，否則，兩個熒光團(tuán)將同時被激活并且不會發(fā)生FRET。這意味著需要兩個特定波長來處理兩種熒光團(tuán)，并且能夠?qū)煞N不同波長進(jìn)行成像將使該技術(shù)更快、更有效，因為當(dāng)熒光強(qiáng)度中一個波長減少而另一個波長增加時，會立即清楚。 FRET 是一種利用分離器的出色技術(shù)，如圖 4所示。

雖然圖 4中的所有三種方法在某些時候都使用分光器，但通過使用多相機(jī)適配器(圖 4C)，可以同時對兩種熒光團(tuán)進(jìn)行成像，使該版本成為最快且很適合活細(xì)胞成像的版本。由于沒有移動部件，也沒有偽影，使用分離器設(shè)備的同步 FRET 增強(qiáng)了技術(shù)并允許更好的實驗，從而改善動態(tài)過程的成像。

圖 4：不同的 FRET 變化。 A) 可以交換兩個不同的分光器立方體(每個波長一個)以對兩個 FRET 波長進(jìn)行成像。該技術(shù)速度較慢，并且可能會引入偽影。 B) FRET 立方體，其中立方體與濾光輪配對，濾光輪選擇要分離的發(fā)射。這比交換立方體更快，并且更適合活細(xì)胞 FRET。C)使用多相機(jī)適配器的同步 FRET，其中可以通過將供體和受體分成兩個相機(jī)來同時測量它們的發(fā)射。此方法沒有移動部件并且同時發(fā)生，使其成為最快且無偽影的方法。

另一種受益于分光器的技術(shù)是全內(nèi)反射熒光 (TIRF)，該技術(shù)涉及從表面反射光以僅對樣品的一小部分進(jìn)行成像。在 TIRF 中，激發(fā)激光的角度使其完全從玻璃樣品載玻片上反射。結(jié)果是所有激發(fā)光都被樣品反射走。然而，在光被反射的區(qū)域，一小部分光會擴(kuò)散到樣品的一小部分中。這種光的延伸被稱為倏逝波，它通常只能穿透樣品約 100 nm，具體取決于顯微鏡光學(xué)器件。倏逝波與反射光的波長相同，因此它仍然會激發(fā)這個小區(qū)域內(nèi)的任何熒光分子。

由于樣品的一小部分被照亮，與標(biāo)準(zhǔn)寬場熒光相比，離焦光少得多，信噪比也更好。由于 TIRF 僅限于單個焦平面(僅照亮約 100 nm 的樣品)，因此它對于研究靠近表面的樣品區(qū)域(例如固定在蓋玻片或細(xì)胞膜表面上的分子)特別有用。

由于曝光時間短和單焦平面，TIRF 通常用于動態(tài)過程成像。為了使該技術(shù)更快并能夠?qū)Χ鄠€熒光團(tuán)進(jìn)行成像，分光器的使用取得了巨大成功，使 TIRF 更加強(qiáng)大。使用分離器，可以同時執(zhí)行多通道 TIRF(如圖 5C所示)，從而針對非?？焖俚氖录?yōu)化該技術(shù)。

圖 5： TIRF。 A) 單細(xì)胞的 TIRF，蓋玻片反射光產(chǎn)生的漸逝場會激發(fā)最靠近蓋玻片的精選少數(shù)熒光分子(綠色)。 B) TIRF 光路。 C) 同時多通道 TIRF，別顯示綠色和紅色通道以及組合的同步圖像。

概括

分光器的使用既可以催生新技術(shù)，又可以增強(qiáng)現(xiàn)有技術(shù)，使分光器設(shè)備成為顯微鏡和相機(jī)之間強(qiáng)大的接口，提高研究人員控制光和設(shè)計更靈活和優(yōu)雅實驗的能力。

審核編輯 黃宇