外泌體是一類潛在的生物標(biāo)志物，在細(xì)胞間通訊、疾病診斷和治療中都起著非常重要的作用。為了獲得更準(zhǔn)確的外泌體組成成分/異質(zhì)性/功能的信息，并將其實(shí)際應(yīng)用于臨床，近年來(lái)科研人員報(bào)道了一系列分離外泌體的方法?；谖⒘骺氐姆椒梢圆倏匚⒚?納米級(jí)顆粒和實(shí)現(xiàn)高通量分析，東北大學(xué)王建華課題組綜述了近幾年基于微流控的外泌體分離方法，包括免疫親和微流控芯片、尺寸介導(dǎo)微流控分離芯片和多方法集成的微流控裝置等，并在此基礎(chǔ)上介紹了將微/納流控與先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于（單）囊泡水平上外泌體分離分析的方法。此外，該綜述文章還討論了機(jī)器學(xué)習(xí)和智能算法在單外泌體的多維檢測(cè)方面的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。相關(guān)工作以“Microfluidic Strategies for the Isolation and Profiling of Exosomes”為題發(fā)表于Trends inAnalytical Chemistry期刊。

圖1 基于微流控芯片的外泌體分離和單個(gè)細(xì)胞外囊泡分析的方法

免疫親和微流控分離方法

外泌體包含多種跨膜蛋白（CD63，CD9和CD81等）和生物標(biāo)志物蛋白（EpCAM，HER2和CA-125等）。因此，基于外泌體表面蛋白和抗體/適配體之間的特異性結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)外泌體的免疫親和捕獲。免疫親和微流控分離方法可以分為兩類：（1）抗體/適配體修飾磁珠捕獲體液內(nèi)外泌體；（2）具有抗體/適配體修飾界面的微流控芯片實(shí)現(xiàn)外泌體的分離。基于磁珠的微流控芯片可以使用磁鐵將磁珠保留在微流控腔室內(nèi)以同時(shí)實(shí)現(xiàn)外泌體的免疫親和捕獲和下游分析。通過(guò)制備具有多孔表面/微柱的微流控芯片以實(shí)現(xiàn)外泌體的高效捕獲，并結(jié)合釋放機(jī)制獲得完整的外泌體。綜上，免疫親和微流控方法可以實(shí)現(xiàn)外泌體的高純度和高特異性捕獲和分離，但是存在因外泌體異質(zhì)性導(dǎo)致的捕獲效率不高、修飾步驟繁瑣等缺點(diǎn)。

圖2 基于免疫親和微流控的外泌體分離方法

尺寸介導(dǎo)微流控分離方法

尺寸介導(dǎo)的微流控分離方法提供了從小尺寸蛋白質(zhì)和其它大尺寸囊泡中有效分離外泌體和區(qū)分外泌體亞群的機(jī)會(huì)。該方法包括主動(dòng)分離和被動(dòng)分離。主動(dòng)分離方法通常需要引入外加力場(chǎng)（聲場(chǎng)和電場(chǎng)）來(lái)實(shí)現(xiàn)外泌體的分離。被動(dòng)分離則是基于流體動(dòng)力學(xué)達(dá)到區(qū)分不同尺寸顆粒的目的。例如，基于確定性側(cè)向位移（DLD），具有納米級(jí)孔徑的過(guò)濾膜、納米線和粘彈性流體等原理的微流控芯片可以實(shí)現(xiàn)生物體液中外泌體的無(wú)標(biāo)記、無(wú)外加場(chǎng)分離。

圖3 基于尺寸介導(dǎo)的微流控分離方法

集成微流控分離方法

為了克服上述微流控分離方法所存在的缺點(diǎn)，研究者們嘗試將其中一些方法結(jié)合起來(lái)實(shí)現(xiàn)外泌體的高效分離。例如，將主動(dòng)分離方法（電場(chǎng)）與被動(dòng)分離方法（過(guò)濾膜）相結(jié)合實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記、操作時(shí)間短、回收率高、損傷小等優(yōu)點(diǎn)的外泌體高效分離，并實(shí)現(xiàn)下游分析。

圖4 基于尺寸介導(dǎo)的/集成微流控分離方法

單外泌體分離分析方法

外泌體的大小、組成成分、功能和細(xì)胞來(lái)源各不相同導(dǎo)致其存在強(qiáng)異質(zhì)性。此外，外泌體的異質(zhì)性也可能受到器官和組織起源的影響。因此，在單囊泡水平上了解和分析外泌體的性質(zhì)是非常重要的。但是，大量已報(bào)道的方法都是集合分析方法，所獲得的數(shù)據(jù)為外泌體的平均信息，而單個(gè)外泌體的信息仍然未知或未被檢測(cè)到。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的技術(shù)來(lái)闡明單個(gè)外泌體的組成、功能和異質(zhì)性等。該文介紹了目前已實(shí)現(xiàn)單外泌體分析的檢測(cè)技術(shù)，包括超分辨顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡、納米等離激元傳感器等，并重點(diǎn)總結(jié)了先進(jìn)技術(shù)與微/納流控相結(jié)合應(yīng)用于單外泌體分析的方法。微流控芯片的使用不僅方便于實(shí)驗(yàn)條件的控制，而且減少了樣品需求量。此外，強(qiáng)調(diào)了結(jié)合算法和機(jī)器學(xué)習(xí)的微流控分離分析策略在單個(gè)外泌體成像或檢測(cè)方面顯示出的巨大潛力。

圖5 單外泌體檢測(cè)方法

綜上所述，隨著外泌體在癌癥診斷和治療中的潛力日益增長(zhǎng)，開(kāi)發(fā)一種適用于臨床應(yīng)用的高效分離外泌體的方法變得越來(lái)越重要。微流控技術(shù)由于其易于集成操作、樣品消耗少、高通量等優(yōu)勢(shì)，在分離外泌體方面展現(xiàn)出了巨大的前景。作者主要總結(jié)和介紹了用于分離和分析復(fù)雜生物樣本中外泌體的微流控芯片；提出了基于微流控的策略有望實(shí)現(xiàn)從少量生物體液中分離單個(gè)外泌體，并與先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)、機(jī)器學(xué)習(xí)和算法相結(jié)合實(shí)現(xiàn)單外泌體的多維分析。相關(guān)工作為了解外泌體作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)和未來(lái)發(fā)展方向，加速了外泌體相關(guān)研究從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用。

審核編輯：郭婷