在生物醫(yī)學(xué)研究中，動(dòng)物模型的重要性不言而喻。其中，小鼠是使用較多的模型之一。大多數(shù)小鼠在研究時(shí)的年齡在4周到20周之間，但是并沒(méi)有系統(tǒng)性的研究揭示年齡和性別對(duì)模型生理和病理的影響，忽略了年齡和性別水平上潛在的分子差異。因此，本文作者利用4D質(zhì)譜技術(shù)深度解析了不同年齡的雌雄小鼠爪部皮膚和坐骨神經(jīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，為臨床前研究提供了有價(jià)值的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)資源。

研究?jī)?nèi)容

1、DIA-PASEF 可對(duì)小鼠爪部皮膚和坐骨神經(jīng)進(jìn)行深度可重復(fù)的蛋白質(zhì)組分析

本研究中，研究者分析了不同年齡（4周和14周）以及不同性別（雄性和雌性）共16只小鼠爪部皮膚和坐骨神經(jīng)（SCN）的蛋白質(zhì)組學(xué)差異。研究者首先比較了兩種labelfree定量蛋白質(zhì)組檢測(cè)策略，即DDA和DIA的檢測(cè)效果。使用混合皮膚多肽和SCN多肽作為質(zhì)量控制（QC），用DIA模式計(jì)算了所有QC樣品的pearson相關(guān)系數(shù)。

混合皮膚和SCN的平均相關(guān)性分別為0.98和0.99，表明儀器設(shè)置的一致性和穩(wěn)定性。通常情況下，DIA數(shù)據(jù)是根據(jù)同一樣本DDA數(shù)據(jù)構(gòu)建的肽文庫(kù)進(jìn)行搜索的，因此，只能識(shí)別和量化文庫(kù)中存在的蛋白質(zhì)。而DIA-NN，一個(gè)最近開(kāi)發(fā)的基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的程序，無(wú)需構(gòu)建肽文庫(kù)而是直接搜索的方式廣泛地改進(jìn)了DIA的分析流程。

研究者使用MaxQuant分析DDA數(shù)據(jù)，用DIA-NN無(wú)文庫(kù)分析DIA數(shù)據(jù)并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)DIA高度覆蓋了DDA的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，DIA模式下比DDA在皮膚和SCN中檢測(cè)到額外的4135和3926個(gè)蛋白質(zhì)groups（后文省略groups）。DIA結(jié)果的變異系數(shù)（CV）更小，表明該模式比DDA重復(fù)性更高。因此，研究者使用DIA結(jié)果用于進(jìn)一步研究。

Fig.1 DIA-PASEF在分析小鼠爪部皮膚和SCN蛋白質(zhì)組時(shí)優(yōu)于DDA-PASEF

2、小鼠爪部皮膚和SCN中蛋白質(zhì)豐度的年齡差異

研究者在小鼠爪部皮膚中鑒定到蛋白質(zhì)超過(guò)8600個(gè)，包括所有 50 種已知的角蛋白和 19 種膠原蛋白、白細(xì)胞介素 (IL) 家族的 13 個(gè)成員和 S100 家族的 11 個(gè)成員。在SCN中，鑒定到約8400個(gè)蛋白質(zhì)，包含約94%的髓磷脂蛋白質(zhì)。此外，SCN中還鑒定到離子通道蛋白（如Trpv1等）。

由于離子通道蛋白豐度較低及其疏水性很難被質(zhì)譜檢測(cè)到，側(cè)面表明Tims TOF DIA檢測(cè)蛋白質(zhì)的深度和高性能。主成分分析（PCA）將樣品按年齡區(qū)分開(kāi)，無(wú)論是在爪部皮膚還是SCN中，這說(shuō)明年齡是一個(gè)突出的鑒別因素。對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行模糊C均值聚類分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)模式與年齡具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，一部分蛋白質(zhì)在年齡／性別組中表現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢(shì)。

例如，皮膚蛋白質(zhì)組cluster 6中的大多數(shù)蛋白質(zhì)在雌性中顯示出輕微的年齡依賴性變化，而與4周齡雄性相比，14周齡雄性的豐度顯著增加。這些結(jié)果表明，爪部皮膚和SCN的部分蛋白質(zhì)表達(dá)模式存在性別和年齡的特異性，這可能會(huì)影響小鼠的生理/病理狀態(tài)。

Fig.2 爪子皮膚和SCN蛋白質(zhì)組的年齡和性別差異

3、爪部皮膚中生物學(xué)通路的年齡與性別差異

為進(jìn)一步探究蛋白表達(dá)與年齡的相關(guān)性，研究者篩選了|log2FC>=0.585|且q-value<=0.05的蛋白質(zhì)作為差異蛋白（DEP），在雌性和雄性的結(jié)果中各找到234和94個(gè)皮膚DEP，其中46個(gè)同時(shí)存在于2個(gè)性別組中。對(duì)這46個(gè)DEP進(jìn)行GO富集分析（BP方向）發(fā)現(xiàn)了3個(gè)顯著的條目。

與14周相比，4周的皮膚組富集了與皮膚發(fā)育相關(guān)的途徑，如“蛋白質(zhì)羥化”和“膠原纖維組織”，幾種脯氨酸/絲氨酸羥化酶和膠原蛋白成員在4周組中上調(diào)表達(dá)。對(duì)雄性和雌性組的DEP分別進(jìn)行GO-BP富集分析發(fā)現(xiàn)，在雄性皮膚中，“缺口信號(hào)”和“外在凋亡信號(hào)”條目在4周時(shí)顯著豐富，而“肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞收縮”和“參與形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞成分組裝”在 14周時(shí)顯著豐富。在雌性皮膚中，與4周相比，14周時(shí)顯著富集了多個(gè)有助于皮膚穩(wěn)態(tài)的條目。

Fig.3 爪部皮膚樣本的差異表達(dá)分析揭示了雄性和雌性小鼠不同的年齡相關(guān)的生物學(xué)通路

4、SCN 中免疫通路和髓磷脂蛋白的年齡與性別差異

在雌性和雄性SCN中，根據(jù)年齡進(jìn)行差異比較分析，各發(fā)現(xiàn)929和1269個(gè)DEP。通路富集分析發(fā)現(xiàn)，在兩種性別中的共有DEP中，“囊泡定位”在4周的Z分?jǐn)?shù)更高，而與“神經(jīng)元存活”、“神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸”和“順行軸突運(yùn)輸”相關(guān)通路在14周更顯著。

在SCN結(jié)果中，搜索已知在免疫細(xì)胞中表達(dá)的神經(jīng)元受體的配體蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)有19個(gè)蛋白在兩種性別中都表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的豐度差異。研究者根據(jù)這些結(jié)果提出一個(gè)假設(shè)，即在年幼小鼠的SCN中存在一種特殊的動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制，可在受體水平上平衡配體的豐度。

髓鞘蛋白質(zhì)中有21種的豐度受年齡調(diào)節(jié)，包括高豐度的結(jié)構(gòu)髓鞘蛋白，如MBP和MPZ。MBP和MPZ在14周的雄性和雌性SCN中都上調(diào)表達(dá)，反映了髓鞘組裝和軸突隨年齡的發(fā)育。然而，一些與年齡相關(guān)的髓鞘DEP是性別特異性的。進(jìn)一步研究這些與性別和年齡相關(guān)的變化可能有助于更好地了解髓鞘的分子結(jié)構(gòu)以及相關(guān)的病理。

Fig.4 不同年齡SCN樣品的差異表達(dá)分析

5、不同年齡組爪部皮膚和SCN蛋白質(zhì)組的性別二態(tài)性

接下來(lái)，研究者研究了4周和14周時(shí)雄性和雌性組的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，并在皮膚和SCN中分別找到58個(gè)和33個(gè)DEP，并且它們?cè)?周和14周的性別差異有明顯不同。與14周相比，4周的變化不明顯。在4周的SCN中沒(méi)有找到任何DEP。GO-BP富集分析發(fā)現(xiàn)在14周皮膚和SCN的性別比較結(jié)果中，“補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)”顯著富集。補(bǔ)體系統(tǒng)與免疫、宿主防御、炎癥和相關(guān)病理學(xué)密切相關(guān)，因此，這種性別二態(tài)性會(huì)為今后的研究，特別是使用嚙齒動(dòng)物疾病模型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供重要指導(dǎo)。

Fig.5 差異表達(dá)分析揭示爪部皮膚和SCN中蛋白質(zhì)特征的性別差異

6、與皮膚病和疼痛相關(guān)的多種蛋白質(zhì)具有年齡與性別差異

研究者將人皮膚病轉(zhuǎn)錄圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)反向翻譯成小鼠數(shù)據(jù)，并和自己的結(jié)果進(jìn)行比較，找到了907個(gè)致病基因中的329個(gè)。其中27個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出顯著的年齡和/或性別差異。對(duì)這329個(gè)皮膚病相關(guān)蛋白的聚類分析不僅揭示了年齡和性別組之間的離散豐度模式，而且當(dāng)比較四個(gè)組時(shí)發(fā)現(xiàn)了不同表達(dá)模式的蛋白質(zhì)。

Cluster6的蛋白質(zhì)在14周的雄性皮膚豐度更高；而與14周相比，cluster7的蛋白質(zhì)在4周的皮膚中豐度較低。轉(zhuǎn)錄因子 Sp1 (Sp1) 和多功能蛋白聚糖核心蛋白 (Vcan) 在4周雌性皮膚的豐度較低（與14周雌性相比）。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)蛋白 ig-h3 (Tgfbi) 和Sp1在 14 周的雌性皮膚中豐度更高，但在雄性中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似的顯著差異。這些結(jié)果表明，人類皮膚病相關(guān)蛋白的表達(dá)在小鼠中受到年齡和性別影響，這對(duì)皮膚反向翻譯研究具有極其重要的意義。

SCN 受到各種病理的影響，例如神經(jīng)損傷和神經(jīng)性疼痛，在這種情況下，研究者通過(guò)與三個(gè)公開(kāi)可用的疼痛基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，評(píng)估了 SCN 數(shù)據(jù)集中已知疼痛相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平。在 841 個(gè)疼痛基因中，有 245 個(gè)在我們的 SCN 蛋白質(zhì)組中被定量檢測(cè)到，并且這245個(gè)疼痛相關(guān)蛋白的豐度分布因年齡和/或性別而異。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Ace)表現(xiàn)出明顯的年齡和性別差異，而其家族成員Ace2只顯示出年齡差異(即在成年小鼠中表達(dá)較高)。FK506結(jié)合蛋白51(Fkbp5)也顯示出顯著的年齡和性別差異，與4周小鼠相比，其在雌性成年小鼠中的表達(dá)較低，而在雄性成年小鼠中的表達(dá)較高。這些結(jié)果表明蛋白質(zhì)豐度在不同年齡和性別中的變化對(duì)于臨床前疾病模型研究的重要性。綜上所述，本研究的數(shù)據(jù)結(jié)果強(qiáng)調(diào)了性別與年齡匹配的平行性生物醫(yī)學(xué)研究的必要性。

Fig.6 與皮膚病和疼痛相關(guān)的多種蛋白質(zhì)表達(dá)受年齡和/或性別影響

結(jié)果總結(jié)

本研究采用優(yōu)化的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，深入剖析小鼠爪部皮膚和SCN這兩個(gè)組織與傷害性和疼痛，以及與炎癥、損傷和脫髓鞘相關(guān)疾病的關(guān)系。研究者的分析揭示了與小鼠年齡和/或性別相關(guān)的蛋白質(zhì)亞群和網(wǎng)絡(luò)，其中包括已知的(病理)生理相關(guān)的蛋白質(zhì)/生物通路，比如皮膚中的動(dòng)態(tài)平衡和表皮信號(hào)，以及在SCN中，多髓鞘蛋白和神經(jīng)元發(fā)育的調(diào)節(jié)因子。

與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)比較發(fā)現(xiàn)，與皮膚病和疼痛相關(guān)的多種蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著受到年齡和/或性別影響，揭示了蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)水平上迄今未知的性別和年齡差異。

審核編輯：劉清