微小RNA（miRNA）是一種約有19至24個核苷酸的非編碼RNA，具有高度保守性、時序性和組織特異性。miRNA廣泛存在于各種真核細胞中，作為基因表達的重要內(nèi)源性調(diào)控因子，與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。有研究表明，乳腺癌、肺癌、前列腺癌等癌癥的共同特征是miRNA的異常表達。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以作為一種非侵入性的血液、尿液、唾液分析的生物標志物，在疾病早期篩查與診斷等領域中具有較大應用潛力。

然而，由于miRNA序列較短，而且各種miRNA之間相似度非常高，這些特點對檢測方法的適用性和特異性提出了要求。再加上檢測過程中復雜樣品的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的干擾，使得miRNA的檢測并不容易?，F(xiàn)有的檢測方法通常需要復雜的程序來分離、提取和富集miRNA，常常依賴于昂貴的設備和訓練有素的操作人員。這些要求限制了現(xiàn)有方法在資源有限的環(huán)境下對復雜生物樣本的分析應用。因此，開發(fā)一種操作便捷、成本低廉且可靈敏檢測復雜樣本中的miRNA的方法，有助于降低miRNA檢測實驗對于環(huán)境、人員等的高要求，拓展miRNA檢測的實驗場所。

近日，首都師范大學張璐團隊基于微流控可控組裝技術，設計制備出了一種探針鎖定-解鎖可轉換系統(tǒng)并將其應用于無標記miRNA檢測中，實現(xiàn)了miRNA的低成本、高靈敏度檢測。該論文以“Label-free microRNA detection using a locked-to-unlocked transforming system assembled by microfluidics”為題，發(fā)表在Lab on a chip期刊上。

具體而言，研究人員利用微流控技術高效合成了探針鎖定-解鎖可轉換系統(tǒng)，該系統(tǒng)的核心成員是DNA序列（G4m）與鏈霉親和素磁珠（MBs）的復合物，簡稱為MBs-G4m。G4m的序列包含miRNA識別序列和富含鳥嘌呤的富G序列。G4m的兩端修飾了生物素，MBs的表面修飾了鏈霉親和素，使用微流控技術將兩者通入微通道內(nèi)進行可控結合。

經(jīng)過參數(shù)優(yōu)化，研究人員得到了G4m兩端均修飾在同一MBs表面上的復合物，即MBs-G4m。該復合物中的G4m兩端被固定，G4m中的富G序列無法自由折疊，使得體系處于探針鎖定系統(tǒng)。當該體系遇到目標miRNA時，MBs-G4m復合物中的miRNA識別序列會捕獲目標miRNA，形成DNA/RNA雙鏈。

此時溶液中的雙特異性核酸酶發(fā)揮作用，將DNA/RNA雙鏈中的DNA（miRNA識別序列）降解，目標miRNA會被釋放回溶液中進行下一次循環(huán)。降解之后，MBs-G4m復合物進入解鎖狀態(tài)，G4m的一端被釋放，富G序列可以自由折疊，從而完成了由鎖定到解鎖的轉換。

在解鎖狀態(tài)下，研究人員通過磁分離技術將MBs-G4m復合物從復雜樣本中分離出來。解鎖態(tài)復合物中的富G序列可以與血紅素組裝形成G-四鏈體/血紅素DNA酶。利用該DNA酶催化底物顯色的能力，將目標miRNA的數(shù)量信息轉換成易于測定的吸光度信息，從而實現(xiàn)了血清等復雜樣本中miRNA的定量檢測（圖1）。

圖1 （a）探針鎖定-解鎖可轉換系統(tǒng)檢測miRNA原理圖；（b）檢測miRNA的顏色變化圖

綜上所述，研究人員利用微流控技術高效合成了探針鎖定-解鎖可轉換系統(tǒng)，只需2分鐘就可以制備出足夠的MBs-G4m復合物用于miRNA檢測實驗。該復合物擁有良好的磁響應性和miRNA報告能力，可以通過磁分離減少復雜基質(zhì)中干擾組分對miRNA檢測的影響，實現(xiàn)復雜生物樣本中miRNA的準確、簡便的定量分析。這種基于微流控技術快速合成探針的新檢測體系為在復雜基質(zhì)中靈敏且方便的檢測miRNA提供了一種新的思路。

審核編輯：劉清