細胞外囊泡（EVs）由不同類型細胞產生，對細胞間交流至關重要。不同細胞來源的EV亞群可以準確地與各自對應受體細胞精確相互作用，進行內化并發(fā)揮功能。因此，分離多個EVs亞群對于充分解析EVs生物功能具有重要意義。 目前已經開發(fā)了多種EVs分離技術，包括超速離心、尺寸排阻和親和分離等。其中，親和分離通常具有較好選擇性，其原理為主要通過抗體/核酸適體等識別分子對EVs上單一生物標志物的相互作用以實現(xiàn)EVs分離。然而，盡管在某些應用中親和分離行之有效，但由于大多數(shù)EVs亞群缺乏特異性單一生物標志物，所以較難實現(xiàn)它們與密切相關的EVs混合群體的明確區(qū)分。

基于適體識別的DNA計算技術的快速發(fā)展為EVs分離分析離提供了一種強有力的工具。宋彥齡教授團隊前期已發(fā)展了基于雙適體鄰位連接的特定EV亞群的高靈敏檢測方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 7582），以及基于適體靶向識別和代謝標記的EV特定蛋白糖基化成像方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 18111）。然而，考慮到邏輯計算設計的復雜性以及EVs的高度異質性，現(xiàn)有的方法往往一次只能定量一個特定的EVs亞群，難以同時分離多個EVs亞群。由于分離方法的缺乏，目前難以實現(xiàn)對多個EVs亞群同時分離分析及下游分析，從而阻礙了對EVs亞群生物學功能和臨床應用的深入探索。因此，亟需發(fā)展一種多EVs亞群的分離策略。

近日，廈門大學宋彥齡教授團隊在國際期刊small methods上發(fā)表了題為“Isolation of PD-L1 Extracellular Vesicle Subpopulations Using DNA Computation Mediated Microfluidic Tandem Separation”的研究論文，開發(fā)了一個模塊化的串聯(lián)微流控分離平臺（如圖1所示），能夠將多個結合事件作為輸入，進行邏輯計算，并產生兩個獨立的輸出，用于串聯(lián)微流控芯片的EVs亞群分離。該平臺利用雙適體識別的優(yōu)異選擇性和串聯(lián)芯片的靈活性，實現(xiàn)了腫瘤PD-L1 EVs和非腫瘤PD-L1 EVs的順序分離。因此，所開發(fā)的平臺不僅能有效區(qū)分癌癥患者和健康志愿者，還能為評估免疫異質性提供新的線索。此外，捕獲的EVs可以通過DNA水解反應高效釋放，與下游的質譜分析兼容，進行EV蛋白質組分析?？偟膩碚f，這一策略有望分離出不同的EVs亞群，將EVs轉化為可靠的臨床生物標志物，并準確研究不同EVs亞群的生物學功能。文章通訊作者為廈門大學宋彥齡教授，第一作者為廈門大學碩士研究生盧銀珠與林冰倩博士。

圖1 DNA計算介導的微流控串聯(lián)實現(xiàn)PD-L1細胞外囊泡亞群分離的原理

該論文將肺癌患者和健康志愿者的血漿樣本用來研究所開發(fā)策略的臨床效用。將血漿樣本與親和探針和開關探針孵育后通入到串聯(lián)芯片中。如圖2A所示，對于T-Chip，癌癥患者捕獲的EVs數(shù)量遠遠高于健康志愿者（t檢驗：P = 0.0006）。而對于N-Chip，除了一些健康志愿者的數(shù)值較高外，兩類樣品的區(qū)別并不明顯（圖2B，t檢驗：P = 0.02）。值得注意的是，對于N-Chip分離的PD-L1 EVs亞群，由于腫瘤患者中正常細胞產生的PD-L1 EVs可能因免疫逃逸而被分泌抑制，所以患者捕獲的EVs的平均量低于健康人。如果只是將同一樣本的兩種芯片信號簡單相加，而非順序分離，癌癥患者和健康志愿者的區(qū)別會被削弱（圖2C和2D，t檢驗：P = 0.04，ROC曲線的AUC值為：T-Chip為0.9664，T-Chip + N-Chip為0.7731），這可能是因為免疫異質性導致正常細胞分泌的PD-L1 EVs數(shù)量差異較大造成。這些結果表明，該策略不僅可以通過腫瘤PD-L1 EVs區(qū)分癌癥和正常人，同時可以獲得正常細胞來源的PD-L1 EV亞群的數(shù)量，以協(xié)助免疫異質性評估。

圖2 臨床樣本中腫瘤來源和非腫瘤細胞來源PD-L1 EVs定量

總體而言，所開發(fā)的平臺通過EVs亞群的同時分離，有望能讓人們更好地理解EVs的生物學功能、以及對癌癥進展、免疫反應以及對免疫治療耐藥性的實時評估。

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https://doi.org/10.1002/smtd.202300516