數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)由于其絕對(duì)定量的能力和極高的靈敏度，被廣泛的應(yīng)用于分子診斷領(lǐng)域。然而，與目前的金標(biāo)準(zhǔn)定量PCR（qPCR）相比，dPCR在動(dòng)態(tài)范圍上落后了3 ~ 4個(gè)數(shù)量級(jí)，這極大地限制了其在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，對(duì)一些載量范圍波動(dòng)較大的病毒感染樣本進(jìn)行定量時(shí)，高載量的樣本往往會(huì)使dPCR顯全陽(yáng)性而無法通過泊松分布定量。因此，亟需開發(fā)一種比目前的dPCR動(dòng)態(tài)范圍更大且簡(jiǎn)便易用的新的dPCR策略。

近期，上?？萍即髮W(xué)劉一凡課題組與中科院上海微系統(tǒng)所、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院團(tuán)隊(duì)合作開發(fā)了熒光編碼對(duì)數(shù)稀釋數(shù)字PCR技術(shù)（Flodd-PCR），該方法展示出的動(dòng)態(tài)范圍為10?，比傳統(tǒng)dPCR高了逾兩個(gè)量級(jí)。相關(guān)研究成果以“Fluorescence-coded logarithmic-dilution digital droplet PCR for ultrawide-dynamic-range nucleic acid quantification”為題，發(fā)表在Biosensors and Bioelectronics期刊上。上?？萍即髮W(xué)物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院劉一凡課題組2023屆碩士畢業(yè)生施清源、2021級(jí)博士研究生李婕、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科劉春辰博士為本文共同第一作者，上?？萍即髮W(xué)劉一凡研究員、中科院微系統(tǒng)研究所羅源副研究員、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院鄭磊教授為本文通訊作者。

Flodd-PCR基本工作原理

如圖1所示，F(xiàn)lodd-PCR的基本原理為在一次dPCR反應(yīng)中引入四種對(duì)數(shù)稀釋的樣本濃度，每種稀釋倍數(shù)分別對(duì)應(yīng)一種濃度指示劑熒光強(qiáng)度；在PCR后，液滴將被根據(jù)熒光強(qiáng)度拆分成四組，每組分別進(jìn)行拷貝數(shù)定量。如此以來，一次Flodd-PCR實(shí)驗(yàn)約等效于四組進(jìn)行梯度稀釋的、平行的dPCR實(shí)驗(yàn)，從而大幅提高了動(dòng)態(tài)范圍。

為了實(shí)現(xiàn)上述概念，研究團(tuán)隊(duì)首先設(shè)計(jì)并開發(fā)了一種微流控芯片，該芯片能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)檢測(cè)樣本的連續(xù)對(duì)數(shù)梯度稀釋（20 ~ 1000倍）和并行液滴生成（圖2），F(xiàn)lodd-PCR芯片一共有兩個(gè)入口，一邊通入待檢測(cè)的模板DNA樣本和熒光指示劑，一邊通入PCR所需的其他試劑：酶、引物、探針等。上述兩種溶液經(jīng)過連續(xù)梯度稀釋后將生成4組液滴，每組的液滴內(nèi)DNA模板和熒光指示劑都稀釋在一個(gè)特定的濃度，同時(shí)又使其他試劑（如引物、探針和聚合酶等）保持在正常工作濃度。在熱循環(huán)后，利用商業(yè)化數(shù)字PCR液滴閱讀儀同時(shí)讀取PCR探針熒光和稀釋指示劑熒光，最終根據(jù)熒光指示劑將混合的液滴分成四個(gè)聚類，并分別計(jì)算拷貝數(shù)。

圖1 Flodd-PCR原理流程圖

圖2 Flodd-PCR芯片設(shè)計(jì)及稀釋性能表征

Flodd-PCR的動(dòng)態(tài)范圍表現(xiàn)及臨床有效性驗(yàn)證

接下來，研究團(tuán)隊(duì)通過一系列實(shí)驗(yàn)表征了Flodd-PCR的實(shí)際動(dòng)態(tài)范圍，如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明常規(guī)dPCR的動(dòng)態(tài)范圍僅為4 ~ 40,000拷貝/μL，而Flood-dPCR得益于連續(xù)梯度稀釋的功能，能夠?qū)z測(cè)動(dòng)態(tài)范圍擴(kuò)寬到4 ~ 20,000,000拷貝/μL。此外，團(tuán)隊(duì)還將Flodd-PCR和其他的代表性高動(dòng)態(tài)范圍dPCR方法進(jìn)行了橫向比較，結(jié)果表明Flodd-PCR在實(shí)現(xiàn)超高動(dòng)態(tài)范圍的同時(shí)并沒有增加液滴的數(shù)量，這意味著Flodd-PCR的液滴讀取和傳統(tǒng)dPCR一樣簡(jiǎn)便。

圖3 Flodd-PCR的動(dòng)態(tài)范圍標(biāo)準(zhǔn)

最后，為了驗(yàn)證Flodd-PCR在臨床檢測(cè)上的實(shí)用性，研究團(tuán)隊(duì)將其應(yīng)用于臨床患者樣本中人乳頭狀瘤病毒HPV（16型）的定量檢測(cè)。HPV-16作為高危病毒類型可以在70%的宮頸癌病例中發(fā)現(xiàn)，其病毒載量的動(dòng)態(tài)區(qū)間可達(dá)10?以上，遠(yuǎn)超出了傳統(tǒng)dPCR的動(dòng)態(tài)范圍（約10?）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖4），得益于更高的動(dòng)態(tài)范圍，F(xiàn)lodd-PCR的定量成功率優(yōu)于dPCR，其定量結(jié)果也和金標(biāo)準(zhǔn)qPCR高度一致。以上結(jié)果表明，F(xiàn)lood-PCR技術(shù)可以運(yùn)用到真實(shí)的臨床案例中。

綜上所述，F(xiàn)lodd-PCR是一種新穎的超高動(dòng)態(tài)范圍的數(shù)字PCR技術(shù)，其巧妙地運(yùn)用了微流控技術(shù)和熒光編解碼策略，實(shí)現(xiàn)了多種濃度樣本檢測(cè)的“多路復(fù)用”。此外，F(xiàn)lodd-PCR在操作流程上與傳統(tǒng)數(shù)字PCR高度一致，甚至兼容商業(yè)化數(shù)字PCR設(shè)備，這使得該技術(shù)在實(shí)際推廣上具有重要優(yōu)勢(shì)。

圖4 Flodd-PCR對(duì)臨床HPV樣本的高動(dòng)態(tài)范圍定量






審核編輯：劉清