免疫細胞分泌功能（Immune cell secretion）的調(diào)控是當前生物醫(yī)學(xué)研究的關(guān)鍵所在。例如，細胞免疫療法的成敗與免疫細胞是否能正確分泌殺傷性細胞因子（Cytotoxic cytokines）緊密相關(guān)。傳統(tǒng)研究方法，如流式細胞術(shù)（Flow cytometry），在處理大量細胞樣本時效率不高，難以實現(xiàn)對細胞分泌蛋白的高通量時空間分析。

而目前已發(fā)表的關(guān)于新型單細胞微流控分析系統(tǒng)的研究，例如基于納米孔陣列的微流控分析方法，能夠?qū)蝹€細胞的分泌行為進行實時的時空間監(jiān)控，從而以極高的分辨率揭示單細胞分泌的特性。然而，這類方法只能同時檢測幾百個單細胞，在通量上存在明顯不足，這進一步限制了將這類方法與高通量篩選相結(jié)合的潛力。目前，我們對細胞分泌行為的理解仍非常有限。

近期，美國西北大學(xué)（Northwestern University）及陳·扎克伯格生物研究所（Chan Zuckerberg Biohub Chicago）的Shana O. Kelley研究小組在Nature Biomedical Engineering期刊上發(fā)表了題為“Identification of druggable regulators of cell secretion via a kinome-wide screen and high-throughput immunomagnetic cell sorting”的研究論文，報道了一種用于檢測大量免疫細胞分泌行為的高通量微流控方法。該方法結(jié)合了免疫細胞分選和CRISPR篩選，成功鑒定了調(diào)控小鼠CD4+ T細胞中干擾素-γ分泌的關(guān)鍵激酶。

在之前的研究中，Shana O. Kelley研究小組報道了一種全新的細胞分選方式——免疫細胞磁性親和力靶向（Magnetic affinity targeting of immune cells，MATIC）。該方法能夠根據(jù)細胞表面蛋白的表達量，通過磁力以每小時數(shù)以億計的速度分選目標細胞，使得對各類細胞亞群的快速分選和鑒定成為可能。在此次的研究中，Shana O. Kelley研究小組針對細胞分泌行為重新設(shè)計了磁力分選的機制。具體來說，研究人員設(shè)計了一種在細胞表面原位捕捉分泌蛋白的策略，稱為基于分泌的細胞排序和富集（Secretion-enabled cell ranking and enrichment，SECRE）。

SECRE通過在細胞表面進行多輪的抗體功能化，在細胞表面進行了類似酶聯(lián)免疫吸附檢測（On-cell ELISA）的反應(yīng)。研究人員在對SECRE進行優(yōu)化之后，成功實現(xiàn)了在細胞表面對分泌蛋白的實時定量檢測及磁球標記。標記后的細胞可以通過已有的MATIC系統(tǒng)進行快速分選，以篩選出蛋白分泌量高、中等及低的免疫細胞亞群。

利用SECRE方法在細胞表面進行ELISA反應(yīng)來鑒定特定蛋白的分泌

利用開發(fā)的SECRE方法，研究人員對CD4+ T細胞進行了全基因組CRISPR篩選，并以T細胞分泌干擾素-γ的能力為依據(jù)進行了細胞分選。測序結(jié)果表明，在分泌能力低的細胞亞群中，許多特定的激酶有著重要的影響，包括ACVR1、LRRK、STK10、STK24和SLK等。大部分激酶都有對應(yīng)的小分子抑制劑，這使得對這些激酶通路的功能驗證變得簡單且容易。研究人員在相同的激活條件下，加入了不同的激酶來抑制CD4+ T細胞的干擾素-γ分泌。最終發(fā)現(xiàn)，XMU-MP1（SLK抑制劑）、SB-633825（STK10抑制劑）和Bosutinib（STK24抑制劑）具有最佳的抑制效果。

SECRE與CRISPR篩選方法相結(jié)合，可識別干擾素γ分泌的調(diào)控因子

最后，研究人員在動物模型上展示了小分子抑制劑的治療潛力。具體來說，他們構(gòu)建了一個基于硫酸葡聚醣（DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型。在這類模型中，T細胞干擾素-γ的分泌在結(jié)腸炎的進展中起了關(guān)鍵性的作用。以往的研究已經(jīng)證明過量的干擾素分泌會引起腸道干細胞的死亡和腸道上皮細胞的感染。通過使用XMU-MP1，研究人員將小鼠體內(nèi)干擾素-γ的分泌量降低到了正常水平，這極大地減緩了結(jié)腸炎的發(fā)展。與DMSO對照小鼠相比，在XMU-MP1治療的小鼠體內(nèi)，腸道的多項指標均恢復(fù)了正常，包括腸道的長度、感染水平及Olfm4+的腸道干細胞數(shù)量。這進一步證明了基于SECRE方法的CRISPR篩選可以快速鑒定針對細胞分泌的治療靶點和小分子藥物。

硫酸葡聚醣（DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中干擾素-γ抑制劑的抑制作用驗證

綜上所述，這項研究不僅在細胞分析行為的檢測上實現(xiàn)了技術(shù)創(chuàng)新，更在免疫細胞分泌的分子機制的研究中提供了新的視角和可能性。未來，這種高通量微流控技術(shù)在免疫療法和疾病治療研究中的應(yīng)用前景值得期待。特別是對于自身免疫性疾病，該技術(shù)的應(yīng)用可能有助于快速發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和小分子創(chuàng)新藥，從而為患者提供更有效的治療方案。







審核編輯：劉清