2024年4月17日，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院葉堅(jiān)教授、邵志峰教授團(tuán)隊(duì)在Nature期刊發(fā)表題為“Digital colloid-enhanced Raman spectroscopy by single-molecule counting”的研究論文，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院致遠(yuǎn)榮譽(yù)計(jì)劃博士生畢心緣為論文第一作者，邵志峰教授、Daniel M. Czajkowsky教授為論文共同作者，葉堅(jiān)教授為論文通訊作者。

該研究針對(duì)表面增強(qiáng)拉曼光譜領(lǐng)域內(nèi)定量的挑戰(zhàn)，系統(tǒng)闡述了基于數(shù)字膠體增強(qiáng)拉曼光譜（dCERS）的定量技術(shù)。基于單分子計(jì)數(shù)，dCERS成功實(shí)現(xiàn)了超低濃度目標(biāo)分子的可靠定量檢測(cè)，為表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的普遍應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

研究團(tuán)隊(duì)發(fā)明了數(shù)字膠體增強(qiáng)拉曼光譜（dCERS），利用膠體納米顆粒，可以實(shí)現(xiàn)較高效率的單分子檢測(cè)。雖然單分子信號(hào)強(qiáng)度波動(dòng)巨大，這與過(guò)去的研究結(jié)果相吻合，但與常見(jiàn)的單分子表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）技術(shù)不同的是，通過(guò)將光譜根據(jù)是否存在目標(biāo)分子拉曼特征峰進(jìn)行0/1數(shù)字化，亦即陰性光譜和陽(yáng)性光譜（數(shù)字信號(hào)），隨后對(duì)溶液中的陽(yáng)性光譜進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過(guò)該單分子計(jì)數(shù)的方式可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種分子（如染料分子、代謝小分子、核酸、蛋白）的定量檢測(cè)，定量檢測(cè)限可以達(dá)到1fM以下（圖1）。其中，dCERS技術(shù)所采用的膠體顆粒的合成步驟簡(jiǎn)單，易于放大生產(chǎn)，在應(yīng)用中，可以方便地取出每個(gè)批次的少量顆粒來(lái)針對(duì)具體的目標(biāo)分子預(yù)先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而可以可靠地用于后續(xù)未知濃度樣本的定量。

圖1. dCERS定量檢測(cè)原理與不同種類分子的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

在實(shí)驗(yàn)中研究人員發(fā)現(xiàn)，這些通過(guò)閾值確定的單分子事件，其出現(xiàn)次數(shù)的分布完全符合泊松統(tǒng)計(jì)，因此通過(guò)陽(yáng)性光譜的數(shù)量，可以直接簡(jiǎn)單地確定定量靈敏度與準(zhǔn)確性，這與傳統(tǒng)的基于模擬信號(hào)的定量方法完全不同。如圖2所示，通過(guò)增加檢測(cè)總光譜數(shù)，可以累積陽(yáng)性光譜數(shù)量，從而有效提升定量的準(zhǔn)確性，定量檢測(cè)誤差服從泊松噪聲。因此在真實(shí)應(yīng)用場(chǎng)景下，可以根據(jù)分子的檢出概率和對(duì)于準(zhǔn)確性、檢測(cè)總時(shí)長(zhǎng)等的需求，通過(guò)累積陽(yáng)性光譜數(shù)來(lái)調(diào)控定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性，由此dCERS定量檢測(cè)具備精準(zhǔn)可控的可重復(fù)性。

研究發(fā)現(xiàn)還證明，針對(duì)不同的目標(biāo)分子，盡管濃度與單分子計(jì)數(shù)的依賴關(guān)系具有不同的系數(shù)（需要分別進(jìn)行標(biāo)定），這些關(guān)系都符合吉布斯熱力學(xué)的理論。事實(shí)上，這是首次明確建立了單分子統(tǒng)計(jì)的物理基礎(chǔ)，并可能適用于拉曼光譜之外的其它單分子計(jì)數(shù)技術(shù)。

圖2. dCERS定量檢測(cè)誤差服從泊松分布

為了確立dCERS在實(shí)際測(cè)量中的潛力，研究團(tuán)隊(duì)選取了百草枯和福美雙作為展示實(shí)例（圖3）。百草枯是一種高效、劇毒的除草劑，可以誘導(dǎo)帕金森氏病的發(fā)生，目前已有32個(gè)國(guó)家嚴(yán)格禁止其使用。福美雙是一種含硫劇毒殺真菌劑，被歐盟歸為二類致癌物。因此，超高靈敏度、準(zhǔn)確可靠的定量檢測(cè)技術(shù)對(duì)于這些分子的檢測(cè)非常重要，尤其是致癌物，原則上不存在安全劑量。

選取普通的湖水作為背景并混入微量的百草枯，研究團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)了低于歐盟最大殘留量規(guī)定三個(gè)數(shù)量級(jí)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于福美雙，研究團(tuán)隊(duì)選取了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的豆芽提取液，達(dá)到了優(yōu)于質(zhì)譜五個(gè)數(shù)量級(jí)的檢測(cè)靈敏度。并證明了，通過(guò)系列稀釋的方法，檢測(cè)中的背景干擾可以得到完美的抑制，從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的靶分子濃度的測(cè)量。而dCERS的超高靈敏度和可靠的統(tǒng)計(jì)分布是實(shí)現(xiàn)這些定量測(cè)量的關(guān)鍵基礎(chǔ)。

圖3. dCERS在微量分子檢測(cè)中的應(yīng)用

總之，該研究展示了dCERS技術(shù)基于單分子計(jì)數(shù)實(shí)現(xiàn)了超低濃度目標(biāo)分子在未知復(fù)雜背景中的可重復(fù)性定量，無(wú)需使用任何目標(biāo)分子的特定標(biāo)記。由于不同的目標(biāo)分子大多具有獨(dú)特的SERS光譜，dCERS可以實(shí)現(xiàn)多種不同分子的同時(shí)定量檢測(cè)，因此具有很好的應(yīng)用前景。另外，這項(xiàng)工作使用的膠體納米顆?？梢苑奖愕剡M(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)和制備，而檢測(cè)方法相對(duì)簡(jiǎn)單，因此，dCERS有望進(jìn)一步推動(dòng)高靈敏檢測(cè)技術(shù)的變革和進(jìn)步。