微流控技術(shù)是一種通過微小的通道和微型裝置對流體進行精確操控和分析的技術(shù)。它是現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)發(fā)展過程中的一種重要的生物醫(yī)學工程技術(shù)，具有廣泛的應用前景和重要性。它在高通量分析、個性化醫(yī)療、細胞篩選等方面有著巨大的潛力，Aigtek安泰電子今天就將為大家分享一篇微流控領域研究成果，一起接著往下看吧~

人誘導多能干細胞（hiPSC）來源的心肌組織（hiPSC-CM），是一種極具潛力且可減少藥物研發(fā)中動物測試的體外組織模型。然而傳統(tǒng)基于生化因子定向誘導分化所得的心肌組織，其不成熟的特性卻顯著影響了該類組織的實際應用。來自加州大學伯克利分校的KevinE.Healy團隊通過在微流控芯片內(nèi)部有機結(jié)合組織工程手段和培養(yǎng)體系優(yōu)化的方式，大大提高了hiPSC來源心肌組織的成熟度，且這些誘導細胞成熟的因素對心肌細胞動作電位和鈣離子調(diào)控的影響具有表型依賴性。相關論文“Metabolicallydrivenmaturationofhuman-induced-pluripotent-stem-cell-derivedcardiacmicrotissuesonmicrofluidicchips”發(fā)表于雜志NatureBiomedicalEngineering。

基于已有的研究報道，研究者猜想將組織工程手段與可溶性因子優(yōu)化進行結(jié)合，將有望提高現(xiàn)有hiPSC-CM的成熟度。為此，研究者首先在微流控芯片中建立了大小不同、特異性排列的微柱陣列，以作為心肌細胞的附著位點，從而促進多層組織自組裝的一致性，并實現(xiàn)心肌組織的肌節(jié)排列和單軸跳動（圖1）。隨后，研究者將同源的hiPSC-CM和基質(zhì)細胞（hiPSC-SC）在上述芯片微生理系統(tǒng)（MPS）中進行共培養(yǎng)，并探索了葡萄糖、油酸、棕櫚酸和白蛋白（這里選用BSA）等不同碳源對心肌組織成熟度的影響。在10天的培養(yǎng)過程中，研究者通過對心肌組織的跳動現(xiàn)象和鈣通量表征，最終確認同時存在油酸和棕櫚酸兩類脂肪酸、降低葡萄糖含量、提高BSA含量的新型成熟培養(yǎng)基（MM）為最佳促成熟組合。

圖1優(yōu)化的hiPSC來源心肌微生理系統(tǒng)

在完成微流控芯片的構(gòu)建和碳源優(yōu)化后，研究者基于WTC（野生C型）hiPSC建立了心肌微生理系統(tǒng)，并對MM引起的心肌鈣瞬變和動作電位變化進行了系統(tǒng)的表征。結(jié)果表明，MM有效縮短了心肌微生理系統(tǒng)中的心肌動作電位時程（APD），并提高了基線標準化的鈣振幅；但同樣的測試在2D培養(yǎng)的心肌組織中無明顯變化。接著，研究者利用WTC和SCVI20（斯坦福大學心血管生物庫細胞系20）兩類hiPSC來源的心肌組織，探究了MM對不同基因型細胞作用的差異。從動作電位的角度看，SCVI20心肌組織的初始APD更短，但隨著培養(yǎng)時間達到10天，該類組織的APD與WTC心肌和原代成人心肌逐漸趨同；從鈣離子通量的角度看，SCVI20心肌組織與WTC組織具有類似的變化趨勢，但其最大鈣離子上升速度提升更明顯（圖2）。這也初步說明了微流控芯片中的3D培養(yǎng)環(huán)境和優(yōu)化的MM對心肌組織動作電位和鈣瞬變的影響具有協(xié)同效應，且這種影響具有基因型的特異性。

圖2成熟心肌MPS的動作電位表征

隨后，研究者探究了MM對心肌組織中線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。基于熒光表征不難發(fā)現(xiàn)，不同hiPSC來源的心肌組織，其中線粒體內(nèi)跨膜電位都有顯著上調(diào)，提示MM培養(yǎng)基處理后的心肌MPS中氧化磷酸化現(xiàn)象明顯增加。另外，盡管線粒體的密度沒有明顯變化，但MM的處理使其排布更加規(guī)則，并使線粒體延伸出更多絲狀物從而形成網(wǎng)絡。當然，在2D培養(yǎng)的心肌組織中，未發(fā)現(xiàn)上述變化（圖3）。這些數(shù)據(jù)可以說明，優(yōu)化后的MM培養(yǎng)基在心肌MPS中有效改變了細胞中線粒體的狀態(tài)，使心肌組織處于更趨向于成熟態(tài)的代謝表型。

圖3MM處理心肌MPS后的線粒體形態(tài)學變化

接著，研究者觀測了心肌微生理系統(tǒng)中的力學效應。首先，僅從肌節(jié)形態(tài)和排布來看，MM的處理在WTC和SCVI20來源心肌中都不會產(chǎn)生顯著影響。將微流控芯片中微柱的形變轉(zhuǎn)化為受力的大小，可以發(fā)現(xiàn)：在高濃度鈣離子的刺激下，MM處理組和常規(guī)培養(yǎng)基組的心肌組織施力效果相近。然而MM處理后的WTC心肌組織卻表現(xiàn)出對低濃度鈣刺激更敏感的效應。同時，在一定范圍內(nèi)MM處理的心肌MPS會對鈣離子濃度變化響應更為劇烈。當在心肌MPS中施加異丙腎上腺素這一誘因時，WTC和SCVI20來源的心肌組織分別表現(xiàn)為輕微的響應遲鈍或敏感；而時序性改變異丙腎上腺素的刺激時，兩類心肌組織則都表現(xiàn)為響應更為遲鈍（圖4）?？傮w來看，這些數(shù)據(jù)表明MM的處理不會損害肌節(jié)或干擾興奮-收縮耦合及受體反應性；但在細胞外鈣的含量受限時，MM處理則會增強鈣收縮耦合。

圖4MM處理后心肌MPS的變力響應

在接下來的部分，研究者從基因表達的角度表征了MM處理后心肌MPS的變化。結(jié)果表明，MM的處理并不會顯著改變WTC和SCVI20心肌組織中電生理學、細胞特性、收縮性和鈣調(diào)控相關的基因表達。但在WTC心肌組織中，肌脂蛋白和鈣離子通道相關的基因（SLN、HCN2和CACNB2）表達有上調(diào)趨勢，而與鉀離子通道和乙醛脫氫酶相關的基因（KCND2和ALDH1A1）表達則有下調(diào)趨勢。對SCVI20心肌組織來說，與鉀離子通道相關的KCNJ2和KCND2基因分別出現(xiàn)了顯著的下調(diào)和上調(diào)；而與肌脂蛋白和鈣離子通道相關的基因（SLNCACNB2）則只有輕微的上調(diào)。同樣地，很難在2D培養(yǎng)的心肌組織中發(fā)現(xiàn)這些較為顯著的變化（圖5）。

圖5脂基MM處理單層心肌組織和MPS后的基因表達分析

從上述結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，MM的處理在WTC和SCVI20來源心肌MPS中產(chǎn)生了對APD相反的影響，但其最終結(jié)果是使兩者的APD和鈣調(diào)控行為都接近于原代生理組織。當然，這并不意味著兩類心肌細胞內(nèi)的電流值相近，而電流值又直接影響了心肌組織的藥學響應等，因而對細胞內(nèi)電流的測定是一個不可忽視的問題。受限于活細胞很難從心肌MPS中取出的問題，研究者創(chuàng)造性地采用了計算模擬的方式：由APD和鈣離子變化的數(shù)據(jù)來推算細胞內(nèi)的電流值。模擬預測的結(jié)果表明，MM的處理對WTC和SCVI20心肌組織中動作電位的改變和鈣調(diào)控影響的數(shù)值不同，但兩種來源細胞的成熟表型卻非常相似。

圖6單一電流和鈣離子調(diào)控對單層心肌組織和MPS動作電位影響的數(shù)學模型

最后，研究者將不同來源的心肌微生理系統(tǒng)用于藥效學研究，以證明該體外模型的實用價值。文中選用了維拉帕米（Verapamil）、氟卡尼（Flecainide）和阿夫唑嗪（Alfuzosin）等幾類可改善心律不齊的臨床藥物進行測試。結(jié)果表明，盡管WTC和SCVI20心肌組織對不同藥物的具體反應不同，但總體上，在心肌MPS中使用MM培養(yǎng)的組織，能有效減少假陽性(維拉帕米)和假陰性(阿夫唑嗪)藥物反應的預估（圖7）。這進一步證明了該成熟化的微生理系統(tǒng)在藥物評價和預測方面的優(yōu)勢。

圖7成熟的WTC心肌MPS中抗心律失常藥的藥理學研究

總而言之，本文證明了在MPS中使用基于脂肪酸的培養(yǎng)基進行干細胞來源心肌組織的3D培養(yǎng)，可以有效促進hiPSC-CM動作電位的成熟。且所得心肌組織的APD和鈣瞬變行為會更接近于原代生理組織。同時，這種變化是可以經(jīng)過一定的理論模擬來進行判定和預測。而這種較為成熟的心肌組織也有望為相關治療藥物的研發(fā)和藥物安全性測試提供更好的先決條件。

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審核編輯 黃宇