圖 1： Line REscan AION 共聚焦顯微鏡配備兩臺 Kinetix sCMOS 相機，用于多色成像，在 3k x 3k 像素陣列上的速度超過 100 fps。

Line RE掃描 AION 共聚焦系統(tǒng)和 Kinetix 相機的結合為活細胞成像提供了無與倫比的功能。AION具有電動可切換針孔，可為具有大視野的各種物鏡提供精確的共聚焦。Kinetix 提供無與倫比的靈敏度和速度，量子效率 (QE) 高于 95%。這種組合非常適合活細胞成像，因為它能夠對大樣品進行高速圖像采集，并通過實時反卷積和降低光毒性來增強。這種適應性強且用戶友好的系統(tǒng)支持同步雙相機成像，并與顯微鏡機身和軟件無縫集成，在共聚焦顯微鏡中提供前所未有的性能。

介紹

現(xiàn)代顯微鏡是突破生命科學領域人類知識界限的重要工具，隨著硬件或軟件的每一次新發(fā)展，它都會向前邁進一步。轉盤共聚焦顯微鏡是生命科學領域一種流行的成像方法，因為光學切片可在單焦平面內提供更高的分辨率和更清晰的圖像。然而，活細胞轉盤共聚焦顯微鏡面臨局限性，需要更溫和的成像，具有更高的分辨率、更高的采集速率、更高的光譜靈敏度、更大的視場 (FOV) 等。

Confocal NL 的 Line RE掃描 AION 共聚焦裝置提出了一個顛覆性的概念，可在緊湊且經(jīng)濟高效的解決方案中實現(xiàn)高分辨率成像。任何成像設置的關鍵部分是探測器，Teledyne Photometrics 的 Kinetix 是一款突破性的現(xiàn)代背照式 sCMOS 相機，在速度和靈敏度之間取得了平衡，同時為大 FOV 成像提供了最大的商用傳感器之一。

在本文中，我們旨在強調這兩種技術的強大集成，強調它們?yōu)轱@微鏡提供的獨特優(yōu)勢。其結果是一種工程解決方案，能夠在大視場范圍內同時在多達兩個探測器上進行高速成像，所有這些都具有最先進的共聚焦系統(tǒng)的分辨率和軸向切片。

新設置超越的限制

典型的sCMOS相機通常缺乏必須在高速下檢測微弱信號的應用所需的靈敏度和采集速度。使用 Kinetix 可實現(xiàn)兩倍以上的采集速度，并且從可見光到近紅外 (NIR) 波長的 >95% 的高 QE 和最小的噪聲水平(< 1 e-read 噪聲)緩解了以前探測器遇到的瓶頸。Kinetix 傳感器(3200 x 3200 像素，6.5 μm 像素尺寸)在選擇放大設置和其他成像模式時提供了靈活性。該芯片的物理尺寸(對角線為 29.42 毫米，即 FN29)在每一幀中捕獲的數(shù)據(jù)比典型的 sCMOS 相機多得多，但需要與適當?shù)拇?FOV 系統(tǒng)配對，以最大限度地發(fā)揮大型傳感器的優(yōu)勢。

AION 已針對大型樣品進行成像進行了優(yōu)化，并充分利用了 Kinetix 提供的大 FOV 和分辨率，從而提供了傳統(tǒng)系統(tǒng)兩倍以上的 FOV 尺寸。這確立了 AION 和 Kinetix 的硬件組合作為大量不同顯微鏡應用的首選方法，利用更大的 FOV 或隨之而來的高速成像提供的更高的吞吐量。

圖2： 使用 100x 1.50 NA 物鏡將 FN18 系統(tǒng)與 AION 和 Kinetix 提供的 FN25 進行比較。圖像顯示了固定的人成纖維細胞，細胞核 - DAPI(藍色)，線粒體 - Tom20-Alexa488(綠色)，微管 - 微管蛋白 - Alexa555(紅色)，肌動蛋白 - Alexa647(洋紅色)。

AION 設計為在對角線為 25 mm(FN25)的 FOV 處完全衍射限制，適用于對應于 60x 1.4 NA 或更小的物鏡孔徑。這意味著物鏡的 NA/Mag 值必須小于或等于 1.4/60，才能使用 FN25 FOV 提供衍射極限圖像。因此，與更常見的FN18系統(tǒng)相比，使用高放大倍率和高NA物鏡(例如100倍、1.45 NA)在啟用FN25 FOV的系統(tǒng)上成像時，將使樣品表面成像得兩倍(圖2)。AION還配備了可切換的針孔，為各種物鏡(4x-100x)實現(xiàn)了理想共聚焦。

圖 3： 使用 60x 1.42 NA 物鏡將 FN18 系統(tǒng)與 AION 和 Kinetix 提供的 FN25 進行比較。圖片顯示黑腹果蠅卵母細胞、微管 – Alexa 555。

與前代產品相比，AION優(yōu)化的光學器件和智能成像功能，結合Kinetix的速度和靈敏度，提高了共聚焦顯微鏡的質量和通量。AION 有三個不同的版本(α、λ 和 Σ)，硬件配置不同，都可以適應每個常見的顯微鏡輸出。該設計甚至通過結合兩個具有大視場的攝像機來同時對不同通道進行成像。當與兩臺 Kinetix 相機一起使用時，每個通道可以對 25 mm 對角線 FOV(450 x 450 μm2,40 倍物鏡)的每秒 100 幀以上成像。使用動態(tài)反卷積可以實現(xiàn) 170 nm 的實時分辨率，從而在超過 500 μm 的深度生成高質量圖像。針孔的電動化進一步提高了成像質量，其他電動化和自動化功能促進了用戶友好性的提高。

AION提供的照明進一步支持了這種靈活性，該照明可以擁有多達兩倍的激發(fā)線數(shù)量，甚至可以達到近紅外(400-1100 nm)。高成像深度也是該系統(tǒng)的一大優(yōu)勢，可以通過使用更長的波長來減少更深樣品中的像差或散射。盡管是共聚焦系統(tǒng)，但與傳統(tǒng)系統(tǒng)相比，照明模式已得到改進，光毒性降低了數(shù)倍。此功能與活細胞應用高度相關，活細胞應用可以進行更長的持續(xù)時間，并且由于細胞在實驗過程中承受的損傷減少，因此更加可靠。該設置的安裝是用戶友好的，因為它使用開源軟件(如 Micro-Manager)實現(xiàn)所有元素。驅動程序可用于將硬件合并到其他控制軟件中或創(chuàng)建自定義解決方案。

結論

新型 Line RE掃描 AION 系統(tǒng)與多達兩臺 Kinetix 相機相結合，達到了共聚焦技術的頂峰(圖 1)。同時采集如此大的視場，結合高時空分辨率、實時反卷積和高成像深度，提供了一種具有前所未有的能力的成像工具。該系統(tǒng)具有很強的適應性，這要歸功于其簡單的硬件和軟件對可用顯微鏡的實施以及緊湊的結構。AION-Kinetix 組合作為尖端的高質量共聚焦系統(tǒng)是無與倫比的。

審核編輯 黃宇