圖 1： FCS 成像系統(tǒng)。光聚焦在一定的體積內(nèi)，當(dāng)熒光團(tuán)移入激光檢測體積時(shí)可以觀察到分子動(dòng)力學(xué)。改編自 DKFZ_FCS。

介紹

熒光相關(guān)光譜 (FCS) 可測量由于對(duì)目標(biāo)熒光團(tuán)的任何物理、化學(xué)或生物效應(yīng)而產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度波動(dòng)。原則上，光聚焦在樣品的某個(gè)區(qū)域，并測量該區(qū)域的熒光強(qiáng)度的波動(dòng)。熒光強(qiáng)度的這種波動(dòng)可能是由各種動(dòng)力學(xué)引起的，包括粒子的布朗運(yùn)動(dòng)。布朗運(yùn)動(dòng)是液體/氣體中的分子由于與環(huán)境中其他快速移動(dòng)的粒子碰撞而發(fā)生的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的術(shù)語。這會(huì)導(dǎo)致粒子(在本例中為熒光粒子或熒光團(tuán))位置的隨機(jī)波動(dòng)。

對(duì)某個(gè)區(qū)域的 FCS 分析返回該區(qū)域中熒光團(tuán)的平均數(shù)量以及它們穿過該區(qū)域時(shí)的平均擴(kuò)散時(shí)間?？梢赃M(jìn)一步分析該數(shù)據(jù)以了解熒光團(tuán)大小、熒光團(tuán)濃度、溶液粘度和擴(kuò)散系數(shù)。 FCS 是一種極其靈敏的分析工具，因?yàn)樗軌驕y量小體積內(nèi)極少量的分子(納/皮摩爾濃度)。

FCS成像系統(tǒng)

典型的 FCS 成像系統(tǒng)由激光作為激發(fā)源。激光聚焦在樣品的特定區(qū)域，穿過激光焦點(diǎn)體積的熒光分子被激發(fā)并發(fā)出熒光。發(fā)射的熒光通過物鏡返回并被靈敏的科學(xué)相機(jī)檢測到，如圖 1所示。收到的數(shù)據(jù)通常是隨時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度，但可以通過相關(guān)分析進(jìn)行進(jìn)一步分析。

相關(guān)性

為了查看兩個(gè)變量是否相互相關(guān)，我們可以查看相關(guān)性。兩個(gè)變量之間的關(guān)系可以用統(tǒng)計(jì)方式表示，稱為相關(guān)系數(shù)(或皮爾遜相關(guān))。相關(guān)系數(shù)值的范圍可以在 -1 和 +1 之間(記為r)，分別是完美的負(fù)/正相關(guān)，0 表示兩個(gè)變量之間沒有相關(guān)性和沒有關(guān)系。一些示例相關(guān)性如圖 2所示。

圖 2：相關(guān)系數(shù)表示兩組數(shù)據(jù)如何相互關(guān)聯(lián)。 A 和 D 顯示完美否定 (A)或正相關(guān) (D)，這在正常實(shí)驗(yàn)中不太可能出現(xiàn)。 B 和 E 顯示出很強(qiáng)的負(fù)相關(guān) (B) 或正相關(guān) (E)。C幾乎沒有相關(guān)性，數(shù)據(jù)點(diǎn)聚集在一處，沒有明確的關(guān)系，r值接近于0。F 顯示完全不相關(guān)(r = 0)，兩個(gè)變量之間的關(guān)系不是線性的。改編自簡介saylordotorg 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

熒光自相關(guān)

自相關(guān)或序列相關(guān)是信號(hào)與其自身的延遲副本之間的相關(guān)性。換句話說，它是連續(xù)時(shí)間點(diǎn)上同一變量的兩個(gè)值之間的相關(guān)性。與標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性不同，自相關(guān)性只涉及一個(gè)變量與其自身進(jìn)行比較，而不是兩個(gè)變量之間進(jìn)行比較。這允許自相關(guān)來表示原始值和稍后時(shí)間的值之間的相似程度。

在FCS中，熒光自相關(guān)測量不同時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，如圖3所示。這種自相關(guān)函數(shù)(ACF)是研究分子時(shí)的一個(gè)重要變量，因?yàn)闊晒鈭F(tuán)擴(kuò)散系數(shù)(激光觀察體積內(nèi)分子的平均躍遷時(shí)間)與ACF 寬度成反比，熒光團(tuán)濃度與ACF振幅成反比。

圖 3： FCS 中的熒光自相關(guān)。左圖顯示了熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的波動(dòng)，時(shí)間點(diǎn) (t) 和稍后時(shí)間點(diǎn) (t+τ) 之間可能存在自相關(guān)。右圖顯示了時(shí)間點(diǎn) (t) 和稍后時(shí)間點(diǎn) (t+τ) 之間的自相關(guān)函數(shù) (ACF)。

使用 FCS 測量的常見標(biāo)準(zhǔn)之一是熒光分子進(jìn)出觀察體積的擴(kuò)散速率。一旦熒光分子進(jìn)入該區(qū)域，就可以觀察到熒光強(qiáng)度的波動(dòng)。通過將熒光波動(dòng)轉(zhuǎn)換為ACF，可以提取擴(kuò)散系數(shù)和濃度，如圖4所示。

圖 4： FCS 可用于比較活細(xì)胞中不同分子之間的擴(kuò)散速率和濃度。改編自 Macháň, R. 和 Wohland, T. (2014)。

FCCS 和 FLCS

FCS 有許多子技術(shù)，包括熒光互相關(guān)光譜 (FCCS)和熒光壽命相關(guān)光譜 (FLCS)。

FCCS

熒光互相關(guān)光譜 (FCCS)關(guān)聯(lián)來自兩個(gè)不同熒光團(tuán)的信號(hào)，在兩個(gè)單獨(dú)的通道(例如綠色和紅色熒光)中檢測到。當(dāng)光譜不同的熒光團(tuán)附著到兩個(gè)分子上時(shí)，可以進(jìn)行雙色 FCCS，顯示兩種類型熒光團(tuán)之間的相互作用。這對(duì)于研究低分子濃度下的結(jié)合動(dòng)力學(xué)特別有用。本質(zhì)上，F(xiàn)CCS可用于以動(dòng)態(tài)方式研究分子結(jié)合伴侶以及兩個(gè)標(biāo)記蛋白的共定位，如圖5所示。

為了研究兩個(gè)標(biāo)記分子 A(綠色)和 B(紅色)是否是結(jié)合伙伴，可以分析每個(gè)分子的 ACF。如果分子 A (ACFg) 和 B (ACFr) 隨時(shí)間的熒光強(qiáng)度遵循相同的模式并且它們相關(guān)，則這將導(dǎo)致高振幅互相關(guān)函數(shù)( CCF )(圖 5上圖)。另一方面，如果兩個(gè)分子彼此獨(dú)立地圍繞定義的體積移動(dòng)，則這些分子的 不會(huì)相關(guān)，從而導(dǎo)致低振幅CCF(圖 5下圖)。此外，如果只有一個(gè)粒子群具有兩個(gè)標(biāo)簽(綠色和紅色)，則 CCF 的振幅將位于兩個(gè)示例情況之間，如圖 5所示.

圖 5： FCCS 是尋找細(xì)胞中結(jié)合伴侶的有用方法。改編自 Macháň, R. 和 Wohland, T. (2014)。

FLCS

熒光壽命相關(guān)光譜 (FLCS)使用脈沖激光，而不是 FCS 和 FCCS 中的連續(xù)激光。這允許進(jìn)行更復(fù)雜的分析，F(xiàn)LCS 消除了熒光團(tuán)之間的背景或光譜串?dāng)_。當(dāng)熒光團(tuán)無法分離或多個(gè)熒光團(tuán)的熒光壽命不同時(shí)，這非常有用。 FCS、FCCS和FLCS之間的相關(guān)幅度比較如圖6所示。

圖 6： FCS(黑色)、FCCS(紅色)和 FLCS(藍(lán)色/綠色)隨時(shí)間變化的相關(guān)幅度。消除光散射的效果可以在綠色和藍(lán)色跡線之間看到，顯示相關(guān)幅度在技術(shù)之間的差異。

燃料電池系統(tǒng)應(yīng)用

FCS 可以與多種顯微鏡技術(shù)結(jié)合使用，例如共焦、雙光子、受激發(fā)射損耗顯微鏡 ( STED ) 和全內(nèi)反射熒光 ( TIRF )。這些技術(shù)涉及將光聚焦在樣品上，并通過使用 FCS 測量熒光強(qiáng)度波動(dòng)，可以獲得有關(guān)熒光團(tuán)擴(kuò)散、熒光團(tuán)濃度和反應(yīng)速率的附加定量信息。

例如，F(xiàn)CS已被廣泛用于闡明細(xì)胞膜中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的組織。這種組織水平對(duì)于細(xì)胞至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈冊(cè)诩?xì)胞過程(例如內(nèi)吞和信號(hào)傳導(dǎo)途徑)中發(fā)揮著重要作用。通過比較幾種蛋白質(zhì)的擴(kuò)散，已經(jīng)表明一些蛋白質(zhì)對(duì)某些域具有更高的選擇性。另一方面，膽固醇消耗后擴(kuò)散系數(shù)的增加代表相關(guān)蛋白質(zhì)對(duì)富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域的親和力。 FCS 是研究活細(xì)胞分子動(dòng)力學(xué)的強(qiáng)大工具，提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞區(qū)室中的分子和擴(kuò)散的定量答案。

相機(jī)

由于 FCS 是一種觀察少量分子的技術(shù)，因此相機(jī)的視場 (FOV) 并不是重要因素，而 FCS 探測器需要關(guān)注速度和靈敏度。 FCS 相機(jī)需要高量子效率和優(yōu)化的像素尺寸，以及高達(dá)每秒 1000 幀的速度，才能檢測快速動(dòng)態(tài)結(jié)合事件。新的 sCMOS 相機(jī)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)單分子事件的高靈敏度和高速成像，使其適用于 FCS。

總結(jié)

在 FCS 中，激發(fā)光聚焦在定義的體積上，一旦熒光分子通過該體積，熒光強(qiáng)度就會(huì)發(fā)生波動(dòng)。因此，可以獲得 ACF 曲線并獲得重要信息，例如分子在質(zhì)膜中擴(kuò)散的速度、溶液中某些分子的濃度以及在活細(xì)胞中定位結(jié)合伴侶。

大約 50 年前，當(dāng) FCS 首次引入顯微鏡領(lǐng)域時(shí)，由于信噪比較低的缺點(diǎn)，它并沒有引起太多關(guān)注。然而，最近在將多種顯微鏡方法與相機(jī)開發(fā)相結(jié)合后，F(xiàn)CS 克服了這一缺點(diǎn)，并轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘瘜W(xué)和生物物理學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域的敏感技術(shù)。高幀速率和高靈敏度相機(jī)(提供更高的信噪比)可以極大地提高 FCS 方法的效率。因此，背照式 sCMOS 相機(jī)將有助于以極短的曝光時(shí)間進(jìn)行成像，從而提高采集速度，這對(duì)于高速捕獲分子至關(guān)重要。極低的噪音性能在這里也很重要。

審核編輯 黃宇