圖1：動(dòng)態(tài)活細(xì)胞與靜態(tài)固定細(xì)胞。答：活細(xì)胞具有社會(huì)性，通常彼此靠近生長，交換化學(xué)信息，并不斷在動(dòng)態(tài)系統(tǒng)中移動(dòng)。B. 固定單元是靜態(tài)的時(shí)間快照。首先，細(xì)胞被洗滌，然后用固定劑(黃色，如甲醛)處理，接著用對比劑(抗體、染料、鈣指示劑等，紅綠方塊表示)孵育，這些標(biāo)記物可以包圍或進(jìn)入細(xì)胞(因?yàn)樵诖诉^程中細(xì)胞膜被破開)。細(xì)胞隨后被夾在玻璃之間并密封，以避免固定劑蒸發(fā)。

介紹

大量生命科學(xué)研究涉及各種細(xì)胞/組織的成像。成像細(xì)胞和組織時(shí)主要有兩種范式：固定細(xì)胞和活細(xì)胞。

活著 vs 固定

“固定”細(xì)胞是指被保存得盡可能接近“真實(shí)”狀態(tài)的細(xì)胞。細(xì)胞在此過程中死亡，但其形狀和內(nèi)容物大多保留用于成像，且在固定細(xì)胞上進(jìn)行后續(xù)制備步驟比活細(xì)胞更容易。不幸的是，化學(xué)和物理固定過程(如在甲醛中保存)會(huì)不可逆地改變細(xì)胞的組成和外觀，但大致的模式、網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)和DNA可以較大地保持。細(xì)胞在固定過程中也可能被打開，這使得抗體和化學(xué)物質(zhì)能進(jìn)入細(xì)胞，從而更容易成像。

我們今天看到的大量細(xì)胞圖像來自于玻璃培養(yǎng)后，經(jīng)過固定、準(zhǔn)備/染色，最后夾在蓋片之間并密封的細(xì)胞，如圖1所示。這使得這些細(xì)胞可以在相同條件下被成像數(shù)月甚至數(shù)年，基本上將細(xì)胞凍結(jié)在時(shí)間中，從而實(shí)現(xiàn)詳細(xì)分析。然而，這些圖像并不能代表活體系統(tǒng)中的細(xì)胞行為和特征，而活體系統(tǒng)更具有生物學(xué)意義的數(shù)據(jù)。

圖1：動(dòng)態(tài)活細(xì)胞與靜態(tài)固定細(xì)胞。答：活細(xì)胞具有社會(huì)性，通常彼此靠近生長，交換化學(xué)信息，并不斷在動(dòng)態(tài)系統(tǒng)中移動(dòng)。B. 固定單元是靜態(tài)的時(shí)間快照。首先，細(xì)胞被洗滌，然后用固定劑(黃色，如甲醛)處理，接著用對比劑(抗體、染料、鈣指示劑等，紅綠方塊表示)孵育，這些標(biāo)記物可以包圍或進(jìn)入細(xì)胞(因?yàn)樵诖诉^程中細(xì)胞膜被破開)。細(xì)胞隨后被夾在玻璃之間并密封，以避免固定劑蒸發(fā)。

活細(xì)胞成像顧名思義，細(xì)胞在活體時(shí)被成像，通常是在培養(yǎng)基中。與代表永不變化的靜態(tài)單元不同，活性單元代表了隨時(shí)間移動(dòng)和變化的動(dòng)態(tài)單元。這意味著影像隨時(shí)間變化(稱為“延時(shí)攝影”)對活細(xì)胞成像非常重要。然而，對細(xì)胞或組織等復(fù)雜三維物體進(jìn)行長期成像，會(huì)產(chǎn)生四維影像和一系列新的問題。一個(gè)主要問題是對比劑和染色。

細(xì)胞及其內(nèi)部較小結(jié)構(gòu)大多是水，因此是透明的。在玻璃或透明塑料背景上拍攝這些水袋時(shí)，圖像信息不多，因此必須有某種對比劑或染料/染色劑，以顯示所有細(xì)胞成分。對于固定細(xì)胞，你可以直接添加染色劑，因?yàn)檫@些細(xì)胞已經(jīng)死去固定，不會(huì)受到影響。對于活細(xì)胞來說，存在毒性問題，染色活細(xì)胞通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

由于染色問題，大多數(shù)活細(xì)胞成像采用明場技術(shù)，僅用光照亮可觀察到的微弱光源。直到20世紀(jì)40年代相差顯微鏡的發(fā)明，活細(xì)胞成像才真正起飛，因?yàn)槟軌蛟诓皇褂脤Ρ葎?染色劑的情況下更好地觀察活細(xì)胞。

相差顯微鏡

當(dāng)光通過高密度介質(zhì)(水、油、玻璃等)時(shí)，速度會(huì)減慢。離開高密度介質(zhì)后，光的相位略有偏移，相位相位略微偏移，而光線則沒有穿過任何密集物質(zhì)。這被稱為相位偏移。如果相位偏移的光與正常光相遇，它們幾乎會(huì)相互抵消(相消干涉)，導(dǎo)致相交點(diǎn)的光強(qiáng)度大幅降低。

相位對比顯微鏡利用相位偏移來改變光的強(qiáng)度。樣品被穿過光闌的光照射，形成光環(huán)。這個(gè)光環(huán)穿過樣品(比周圍空氣密度高)，并且發(fā)生相位偏移，光線根據(jù)樣品部分的厚度不同，向不同方向折射。大多數(shù)生物樣本厚度不均，會(huì)導(dǎo)致各種不同的折射。這種折射的相位移光穿過由內(nèi)外部分組成的相位環(huán)。如果折射光穿過環(huán)的外層，則會(huì)進(jìn)一步相位偏移，呈現(xiàn)為暗光。 如果折射光穿過環(huán)的內(nèi)側(cè)，它看起來很亮。通過這種方式，細(xì)胞的不同部分根據(jù)厚度呈現(xiàn)明亮或暗淡，從而在圖像中獲得更好的對比度。這種相較于明場的改進(jìn)可見于圖2。

相機(jī)技術(shù)、像素密度和靈敏度的進(jìn)步推動(dòng)了相位對比的進(jìn)步以及定量相位對比的發(fā)展。使用定量相差技術(shù)拍攝的圖像可以自動(dòng)處理，隨時(shí)間從動(dòng)態(tài)單元中提取大量信息。只需一次曝光，圖像還可在不同焦平面拍攝，從而實(shí)現(xiàn)更好的三維成像，尤其是在旋轉(zhuǎn)掃描下，能夠隨時(shí)間拍攝活細(xì)胞的高分辨率三維圖像。這些進(jìn)步使活細(xì)胞成像能夠得到更精確的分析。

圖2： 相位對比顯微鏡與明場顯微鏡。最上排是明場圖像，左側(cè)是顯微鏡孔徑。底排是相同樣品的相位對比圖像，左側(cè)配有暈顯微鏡孔徑。這些透明樣品在明場下難以成像，但在相差成像中，信息量增加則更加清晰。

活熒光顯微鏡

如果由于毒性問題無法用熒光染料染色活細(xì)胞，那么活細(xì)胞能否用熒光顯微鏡成像?相位對比無法像熒光顯微鏡那樣觀察特定蛋白質(zhì)和細(xì)胞組分，限制了可進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)范圍。

解決方案是熒光蛋白(FPs)。其中最著名的是綠色熒光蛋白(GFP)，在另一篇題為《什么是GFP?》的短文中詳細(xì)介紹了它。多種不同顏色的FP使得現(xiàn)場熒光實(shí)驗(yàn)的深度和定制性堪比固定細(xì)胞熒光成像。通過將GFP基因直接插入細(xì)胞基因組，遺傳編碼的FP允許在每次成像中將非侵入性的熒光標(biāo)記附著在任何蛋白質(zhì)或細(xì)胞組分上，即使跨越多代，因?yàn)镕P通常具有遺傳性。圖3中可以看到多FP的實(shí)時(shí)熒光成像。

雖然熒光活成像最初還不確定，但隨著熒光標(biāo)記的引入，對帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)的延時(shí)成像變得可行且簡單，開拓了活細(xì)胞成像的領(lǐng)域。

圖3： 對海膽胚胎進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光延時(shí)成像，細(xì)胞核被青色熒光蛋白(CFP)染色，細(xì)胞核被黃色熒光蛋白(YFP)染色。每張圖片都顯示時(shí)間戳(以毫米：秒為單位)。這些細(xì)胞被描繪成分裂，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)被拉成兩塊相同的部分，準(zhǔn)備分裂。圖像采用激光掃描共焦點(diǎn)顯微鏡拍攝。

活細(xì)胞成像用相機(jī)

在選擇科學(xué)相機(jī)進(jìn)行檢測時(shí)，所需因素會(huì)根據(jù)樣品需求而高度變化。如果樣品移動(dòng)不快且需要長時(shí)間曝光以實(shí)現(xiàn)延時(shí)，CCD是不錯(cuò)的選擇;但如果樣品運(yùn)動(dòng)速度快(如細(xì)胞器)、低光環(huán)境且曝光時(shí)間較短，研究人員通常使用背光式sCMOS相機(jī)。鑒于探測器種類繁多，確保相機(jī)的分辨率、靈敏度、速度和視野與應(yīng)用相匹配。

總結(jié)

總體而言，活細(xì)胞成像是固定細(xì)胞成像的有力替代方案，隨著定量相位對比和活熒光等技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的研究人員開始進(jìn)行細(xì)胞實(shí)時(shí)成像，以獲得最具生物學(xué)意義的數(shù)據(jù)。

審核編輯 黃宇