截止2019年3月，分子診斷產(chǎn)品獲批數(shù)量達(dá)1197項(xiàng)。按照技術(shù)原理，可以將上市分子診斷技術(shù)大致劃分為PCR技術(shù)、分子雜交、基因測(cè)序、核酸質(zhì)譜、生物芯片5大類(lèi)。

未來(lái)3-5年IVD行業(yè)最具發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)品線是什么?

答案無(wú)疑是分子診斷。狹義的分子診斷是基于核酸的診斷技術(shù)。

隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展，分子診斷的內(nèi)涵已經(jīng)從DNA/RNA拷貝、突變等檢測(cè)，拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測(cè)。

從目前市場(chǎng)分子診斷產(chǎn)品來(lái)看，基于核酸診斷技術(shù)的產(chǎn)品仍占主要。

截止2019年3月，分子診斷產(chǎn)品獲批數(shù)量達(dá)1197項(xiàng)。按照技術(shù)原理，可以將上市分子診斷技術(shù)大致劃分為PCR技術(shù)、分子雜交、基因測(cè)序、核酸質(zhì)譜、生物芯片5大類(lèi)。

分子診斷技術(shù)體系

PCR

從各類(lèi)技術(shù)類(lèi)別來(lái)看，PCR技術(shù)由于壁壘相對(duì)較低，國(guó)產(chǎn)化程度高，國(guó)內(nèi)企業(yè)布局相對(duì)較早，因此基于PCR技術(shù)的分子診斷產(chǎn)品占總產(chǎn)品量的70%以上。

PCR技術(shù)是一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，基本原理是在反應(yīng)室中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制，即人為創(chuàng)造核酸半保留復(fù)制條件，使目的DNA在細(xì)胞外完成擴(kuò)增的過(guò)程。通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行分子診斷的流程如下：核酸提取——核酸擴(kuò)增——核酸檢測(cè)。

按照靶標(biāo)數(shù)量劃分，PCR技術(shù)平臺(tái)通?？煞譃閝PCR和ddPCR。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

Real-time PCR，美國(guó)PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的，與普通PCR相比，實(shí)時(shí)定量PCR具有許多優(yōu)點(diǎn)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終對(duì)起始模板的定量分析。

賽默飛QuantStudio 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

ddPCR(數(shù)字PCR)

ddPCR系統(tǒng)利用油包水技術(shù)，在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前將一個(gè)大的反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，將此反應(yīng)體系分割為成千上萬(wàn)個(gè)微滴，即成千上萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系。在此過(guò)程中，樣品被稀釋至單分子水平，并被平均分配到這幾萬(wàn)個(gè)反應(yīng)體系中，每個(gè)微滴中不含或者含有至少一個(gè)待檢測(cè)的核酸靶分子，這樣也相當(dāng)于變相的對(duì)靶基因進(jìn)行富集。

目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)已現(xiàn)10余家數(shù)字PCR儀廠商，其中領(lǐng)航基因自主研發(fā)的數(shù)字PCR系統(tǒng)已獲NMPA認(rèn)證，銳訊生物、新羿生物、STILLA、伯樂(lè)還在申報(bào)中。

領(lǐng)航基因iScanner 5數(shù)字PCR系統(tǒng)

核酸測(cè)序

經(jīng)典的Sanger測(cè)序技術(shù)，被稱作是測(cè)序?qū)媒饦?biāo)準(zhǔn)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用拓展，基因測(cè)序技術(shù)將不斷升級(jí)，也將進(jìn)一步提高占比，成為未來(lái)腫瘤檢測(cè)的主要技術(shù)。目前測(cè)序市場(chǎng)主流為NGS測(cè)序平臺(tái)。

NGS(下一代測(cè)序，也被稱為“二代測(cè)序”)

二代測(cè)序(NGS)在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用快速增漲，其在臨床上的應(yīng)用主要包括疾病目標(biāo)基因集測(cè)序(disease-targeted gene panels)、全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing , WES)和全基因組測(cè)序(whole genome sequencing , WGS)。總體來(lái)說(shuō)，NGS技術(shù)具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)感興趣的基因進(jìn)行精確定位。

在二代測(cè)序領(lǐng)域，筆者知道的測(cè)序平臺(tái)就達(dá)三十多個(gè)，Illumina毫無(wú)疑問(wèn)是行業(yè)巨頭，其市場(chǎng)規(guī)模甚至達(dá)到壟斷地步。目前已獲中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械批準(zhǔn)的基因測(cè)序儀包括：Illumina MiSeq?Dx;華大智造BGISEQ-100、BGISEQ-1000、BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-2000、MGISEQ-200共6款基因測(cè)序儀。

Illumina MiSeq?Dx測(cè)序平臺(tái)

單細(xì)胞測(cè)序

第三代測(cè)序技術(shù)的核心理念是以單分子為目標(biāo)的邊合成邊測(cè)序，單分子測(cè)序平臺(tái)給測(cè)序技術(shù)帶來(lái)新思路，部分已經(jīng)開(kāi)始商業(yè)化推廣，但尚未達(dá)到NGS的規(guī)模。

相比二代測(cè)序，第三代測(cè)序技術(shù)在臨床上的應(yīng)用有明顯優(yōu)勢(shì)：第三代測(cè)序技術(shù)不需要PCR擴(kuò)增，可直接對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行測(cè)序;樣品制備簡(jiǎn)單，測(cè)序成本進(jìn)一步降低；可直接讀取RNA的序列和包括甲基化在內(nèi)的DNA修飾。這些優(yōu)勢(shì)可以大大改善臨床基因測(cè)序的成本、速度和質(zhì)量，但單分子測(cè)序有通量限制，所以并不適合獨(dú)立做全基因組測(cè)序，更適于針對(duì)有限的、個(gè)性化的、目標(biāo)性的應(yīng)用。

幾家重要的單分子測(cè)序平臺(tái)一覽：

Helicos BioSciences：第一臺(tái)真正的單分子測(cè)序儀

Pacific Biosciences(PacBio)：首個(gè)單分子實(shí)時(shí)測(cè)序系統(tǒng)

Oxford Nanopore Technologies：納米孔測(cè)序、迷你測(cè)序儀

分子雜交

核酸分子雜交技術(shù)是利用DNA 變性與復(fù)性的原理，把不同的DNA 單鏈分子或者DNA 與RNA 的混合物放在同一溶液中，在某種理化因素作用下DNA 雙鏈分子解鏈變性，這樣互補(bǔ)序列的DNA 之間或DNA 與RNA 之間形成雜化的雙鏈。

核酸分子雜交技術(shù)可分為Southern 雜交——DNA和DNA分子之間的雜交；Northern雜交——DNA和RNA分子之間的雜交。

蛋白雜交，也叫Western 雜交，蛋白質(zhì)分子雜交是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法，即蛋白質(zhì)分子(抗原—抗體)之間的雜交。

核酸質(zhì)譜

目前核酸分析所使用的質(zhì)譜電離技術(shù)主要還是采用 ESI 和MALDI。 簡(jiǎn)單來(lái)講，兩種電離技術(shù)都是軟電離，ESI 檢測(cè)的特點(diǎn)是生物大分子帶多個(gè)電荷，質(zhì)荷比范圍基本在2000 Da 以下區(qū)間，從而能檢測(cè)幾萬(wàn)乃至更大的生物分子；而MALDI 常得到單電荷峰，與飛行時(shí)間(TOF)分析器搭配，檢測(cè)范圍可以到幾十萬(wàn)道爾頓。

Agena MassARRAY 核酸質(zhì)譜

質(zhì)譜技術(shù)相比于其他檢測(cè)技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定、寡核苷酸與小分子的相互作用、DNA 損傷與修飾等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

由于生物樣品的復(fù)雜性，質(zhì)譜技術(shù)還面臨著一些挑戰(zhàn)和困難。但生物質(zhì)譜技術(shù)是科學(xué)研究的有力工具，隨著臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)質(zhì)譜的了解和應(yīng)用不斷的加深，未來(lái)該檢測(cè)平臺(tái)或可成為規(guī)范實(shí)驗(yàn)室不可或缺的標(biāo)準(zhǔn)裝備。

生物芯片

微陣列芯片

也就是常說(shuō)的基因芯片，又稱DNA微陣列(DNA micro-array)、SNP芯片，是把大量已知序列探針集成在同一個(gè)基片(如玻片、膜)上，經(jīng)過(guò)標(biāo)記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)，對(duì)生物細(xì)胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析。

與傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)相比具有更高的分辨率，可識(shí)別Kb級(jí)別以上的染色體細(xì)微失衡?；蛐酒壳耙殉蔀閲?guó)內(nèi)外臨床遺傳學(xué)診斷的一項(xiàng)常規(guī)的技術(shù)，在遺傳病檢測(cè)、疾病篩查、疾病分型、病原體檢測(cè)、個(gè)性化用藥等方面均呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

全球知名的芯片公司有 Illumina、Affymetrix(于2016年被賽默飛收購(gòu))、安捷倫等。

微流控芯片

微流控芯片( microfluidic chip) 由微米級(jí)流體的管道、反應(yīng)器等元件構(gòu)成，與宏觀尺寸的分析裝置相比，其結(jié)構(gòu)極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比，以最大限度利用液體與物體表面有關(guān)的包括層流效應(yīng)、毛細(xì)效應(yīng)、快速熱傳導(dǎo)和擴(kuò)散效應(yīng)在內(nèi)的特殊性能，從而在一張芯片上完成樣品進(jìn)樣、預(yù)處理、分子生物學(xué)反應(yīng)、檢測(cè)等系列實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

目前使用微流控芯片進(jìn)行指導(dǎo)用藥的多基因位點(diǎn)平行檢測(cè)是主要臨床應(yīng)用領(lǐng)域。

分子診斷的高速發(fā)展離不開(kāi)分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的進(jìn)步。

在過(guò)去的50 年中分子診斷技術(shù)取得了三大轉(zhuǎn)化與3項(xiàng)提升：報(bào)告信號(hào)檢測(cè)從放射核素標(biāo)記向熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)化、操作方法由手工操作向全自動(dòng)化轉(zhuǎn)化、檢測(cè)分析通量從單一標(biāo)志物向高通量多組學(xué)聯(lián)合判斷轉(zhuǎn)化。

不僅如此，儀器檢測(cè)靈敏度、精密度、特異性的也有快速提升。隨著分子診斷技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，分子診斷將會(huì)出現(xiàn)理念的革命性進(jìn)步，高通量技術(shù)將更多的進(jìn)入臨床的實(shí)際應(yīng)用中。具體如何發(fā)展，我們拭目以待。