想象一下，如果我們身體里的細胞無法全部打亂成均勻分布會怎樣？實際上，在那種情況下，基本已經(jīng)只能算是一個巨型的多細胞團了，因為在生物體內(nèi)，只有各種不同的細胞能夠被精確的分選定位，才能形成一個具有多功能分區(qū)且能夠執(zhí)行正常生理活動的生物有機體。

類似的問題如果放到人工研究體系，也是殊途同歸，比如近年來發(fā)展的液滴微流控是一種強大的技術(shù)平臺，可用于多種生物學(xué)應(yīng)用，包括單細胞遺傳學(xué)、抗體發(fā)現(xiàn)和定向進化，但要想篩選在化學(xué)組成上不同的液滴目前仍面臨困難?？墒聦嵣?，在化學(xué)成分不同的液滴中進行以細胞為基礎(chǔ)的生物化學(xué)分析具有許多獨特的優(yōu)勢，尤其是在減少樣品量、成本以及提高產(chǎn)量等方面。

此外，根據(jù)所需特征對不同組分液滴進行分類的能力十分關(guān)鍵，特別是在分離生物或化學(xué)篩選的命中，如可溶性細胞產(chǎn)物如抗體的篩選以及藥物的篩選等。因此，按需分選生產(chǎn)具有不同化學(xué)組成的液滴對基礎(chǔ)和臨床研究都具有重大意義。

新方法&新平臺

近日，來自歐洲分子生物學(xué)實驗室的Christoph A. Merten教授團隊設(shè)計了一種升級版的微流控技術(shù)平臺（micro?uidic Braille valve platform，簡稱Braille Display，BD），用于按需生成具有不同化學(xué)成分（16種不同試劑及其組合）的液滴，并且能根據(jù)熒光信號對具有不同化學(xué)性質(zhì)的液滴進行分選。

該技術(shù)平臺結(jié)構(gòu)緊湊、功能多樣，并且成本效益較高。在應(yīng)用測試方面，這一新型微流控技術(shù)平臺成功完成了針對74種情況篩選癌細胞藥物敏感性的全過程，且能夠根據(jù)酶活性對不同的液滴進行分類。

圖1微流控技術(shù)集成平臺用于藥物篩選和液滴分選

平臺搭建

研究人員首先對芯片構(gòu)造進行了設(shè)計。具體來看，在微流控芯片的常規(guī)基礎(chǔ)上，BD平臺采用64個針口以4×16的矩陣進行排列，并安裝控制器用于驅(qū)動，以打開和關(guān)閉上述芯片上的微閥，從而可以控制和混合16種注入溶液或在微通道中分選液滴（每個分選通道僅使用4個針口）。

圖2總體芯片以及組合控制生產(chǎn)示意圖

系統(tǒng)配備

將芯片平臺建造好后，則需要定制設(shè)定靈活的軟件控制系統(tǒng)，來實現(xiàn)多樣的功能，充分發(fā)揮BD的強大性能。為了充分適配和發(fā)揮平臺的多樣功能，研究人員共設(shè)計了12種應(yīng)用程序用于實現(xiàn)不同的實驗?zāi)康?，例如?yīng)用程序A：藥物篩選型，其中還包括數(shù)據(jù)分析的詳細信息；以及應(yīng)用程序B：液滴分選型，包括分選芯片的制備、實驗設(shè)置和數(shù)據(jù)評估。

圖3分析方法的工作流程示意圖

應(yīng)用示例

（1）組合藥物篩選

在進行組合藥物篩選時，主要分為三個步驟：（i）藥物和對照品的制備；（ii）編碼;（iii）BD上的芯片對接。對于該研究設(shè)計的平臺，體系優(yōu)化后選擇在每個樣本約100個細胞的群體水平上進行分析，從而可以保障更多的細胞-細胞相互作用，提高藥物反應(yīng)。

然而，從細胞群體水平來看，只有最有效的藥物或藥物組合才能被識別，而單個耐藥克隆可能無法分析到。因此，BD平臺也被用于生成具有不同化學(xué)成分的單細胞液滴（每個受試藥物約250個重復(fù)組），從而實現(xiàn)對單個耐藥克隆的識別。

然而，需要注意的是，單細胞液滴形式阻止了幾乎所有類型的細胞-細胞相互作用，因而可能導(dǎo)致藥物敏感性的改變，可以根據(jù)自己的具體應(yīng)用和科學(xué)問題選擇分析模式，或者是進行兩種模式的混合篩選。

圖4組合藥物篩選的實驗裝置及過程

（2）液滴篩選

BD技術(shù)的另一個應(yīng)用是其用于化學(xué)上不同的液滴進行分類篩選。該研究首先采用了基于熒光的條形編碼策略，只要樣品保持在連續(xù)微流陣列中，這些熒光編碼策略就可用于明確標(biāo)記所有的液滴。此外，研究進一步通過在封裝前用抗體對細胞進行染色來確定每個栓塞的相對細胞數(shù)，以提高微流體篩網(wǎng)的可靠性。

所使用的抗體可以與生物酶偶聯(lián)，該酶可以將安培紅（Amplex Red）轉(zhuǎn)化為試鹵靈（resorufin），產(chǎn)生紅色熒光達到對液滴的標(biāo)記。

研究通過試驗成功實現(xiàn)了基于圖像分析的液滴、細胞和果蠅胚胎分選。此外，該平臺可以進一步實現(xiàn)多達八種方式的分選模式，與常規(guī)的二元熒光強度不同，八向排序可以實現(xiàn)更細微的差異研究，如通過將液滴收集到不同強度的“箱”中并進行下游分析，可以研究目標(biāo)群體中的熒光強度梯度。

因此，BD分選集成的平臺不僅可以分析不同藥物處理對樣本的影響，還可以物理分離感興趣的特定樣本群進行下游分析（例如，成像和測序）。

圖5根據(jù)酶活性對液滴進行分類

平臺優(yōu)勢及應(yīng)用總結(jié)

綜合效率和應(yīng)用潛力進行分析，與現(xiàn)有的技術(shù)相比，該集成型BD微流控平臺的主要優(yōu)勢則是成本低、靈活性高，可實現(xiàn)諸如聯(lián)合藥物篩選和個性化癌癥治療等不同的應(yīng)用，也可以用于進行細胞、胚胎或液滴的多通道分選制備。該技術(shù)的進一步優(yōu)化包括提升微流速度已經(jīng)降低整體成本，從而應(yīng)用去其他更多的領(lǐng)域，如組合篩選用于觸發(fā)細胞命運的最佳生長因子組合，可用于細胞分化、再生醫(yī)或出生缺陷的預(yù)防和治療等。

此外，因為該平臺根據(jù)自動圖像分析分離樣品進行特異性分析，有望在基于光學(xué)顯微鏡成像的發(fā)育生物學(xué)中獲得相關(guān)應(yīng)用。

論文鏈接： https://www.nature.com/articles/s41596-022-00740-4







審核編輯：劉清