單分子水平的蛋白質(zhì)分析揭示了集合平均技術(shù)所掩蓋的異質(zhì)性行為。酶的數(shù)字量化通常涉及通過熒光底物的轉(zhuǎn)換來觀察和計(jì)算分成微區(qū)的單分子。然而，這種基于線性信號(hào)放大的策略僅限于周轉(zhuǎn)率足夠高的少數(shù)酶。

近期，來自法國巴黎物理化工學(xué)院 - 巴黎文理研究大學(xué)（ESPCI Paris-PSL Research University）的研究人員提出了一種基于分子編程和液滴微流控的替代性技術(shù)，用于對(duì)各種DNA和RNA加工酶進(jìn)行數(shù)字檢測(cè)。相關(guān)研究成果以“Functional analysis of single enzymes combining programmable molecular circuits with droplet-based microfluidics”為題發(fā)表在Nature Nanotechnology期刊上。

該研究利用一種被稱為可編程超靈敏分子放大器（PUMA）的通用分子電路，該電路對(duì)DNA信號(hào)進(jìn)行閾值指數(shù)放大，并與各種輸入活動(dòng)相耦合。PUMA包括一個(gè)轉(zhuǎn)換模塊，該模塊將目標(biāo)（此處為酶活性）與短DNA信號(hào)鏈的產(chǎn)生聯(lián)系起來，還包括一個(gè)DNA-酶擴(kuò)增系統(tǒng)，該系統(tǒng)最終會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光讀數(shù)。DNA-酶擴(kuò)增系統(tǒng)由三個(gè)DNA模板組成：利用DNA聚合酶（Vent（exo-））和切口酶（Nb.BsmI）構(gòu)成自動(dòng)催化模板，實(shí)現(xiàn)催化信號(hào)鏈的指數(shù)復(fù)制；假模板使一部分信號(hào)鏈?zhǔn)Щ?，從而起到催化引流的作用，以避免由滲漏反應(yīng)引起的非特異性、非靶標(biāo)依賴性擴(kuò)增；而前熒光報(bào)告模板（rT）與信號(hào)鏈雜交，聚合后產(chǎn)生熒光信號(hào)。

此外，研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)轉(zhuǎn)換模塊，將擴(kuò)增開關(guān)連接到用于診斷應(yīng)用的缺口酶Nt.BstNBI（簡(jiǎn)稱NBI）活性，以便用于診斷。研究人員在NBI濃度增加的情況下實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)。正如預(yù)期的那樣，目標(biāo)濃度越高，信號(hào)鏈的產(chǎn)生越快，因此指數(shù)擴(kuò)增開始得越快。該方法的整體靈敏度約為1μ/ml（每毫升毫單位，即約400 fM的活性酶），比基于熒光底物線性轉(zhuǎn)化的分析低四個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖1 NBI缺口酶活性的檢測(cè)原理

利用基于PUMA的檢測(cè)的高靈敏度特性，研究人員設(shè)想了一種通用方法，稱為數(shù)字PUMA（dPUMA），用于單一酶的計(jì)數(shù)。為了對(duì)此進(jìn)行評(píng)估，研究人員在NBI電路中加入不同濃度的目標(biāo)酶，然后分成單分散的微滴，通過終點(diǎn)熒光顯微鏡對(duì)這些微滴進(jìn)行擴(kuò)增和分析。通過量化陽性液滴的比例并假設(shè)隨機(jī)、泊松分布（方法），確定了活性酶的濃度，發(fā)現(xiàn)在廣泛的稀釋系列中，活性酶的濃度與初始輸入濃度成比例，證實(shí)了該酶的準(zhǔn)確數(shù)字檢測(cè)。這種dPUMA工作流程可以與所有一鍋法分析兼容，并適用于多種酶活性分子的絕對(duì)定量。引人注目的是，數(shù)字讀數(shù)顯示催化活性酶的濃度大大低于總酶濃度（由制造商提供），有時(shí)低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。在排除了可能的實(shí)驗(yàn)假象（如乳化過程中酶的失活或損失或大量污染蛋白的存在）后，研究人員得出結(jié)論，樣品確實(shí)包含大量非功能性酶，這可能源于蛋白質(zhì)生產(chǎn)、純化和/或儲(chǔ)存過程中的失活。

圖2 DNA相關(guān)酶的數(shù)字檢測(cè)

為了進(jìn)一步研究酶混合物的組成和進(jìn)化，研究人員使用實(shí)時(shí)版本的dPUMA方案評(píng)估了理論上相同的多肽庫（商業(yè)NBI）的活性分布。研究人員乳化了不同酶濃度的樣品，以測(cè)量不同泊松參數(shù)（λ）下的活性分布。每個(gè)被占據(jù)的液滴內(nèi)的起始時(shí)間被用作酶活性的代表：酶活性越強(qiáng)，擴(kuò)增越快，這一假設(shè)被批量測(cè)量中起始時(shí)間和酶活性之間的單調(diào)關(guān)系所證實(shí)。從圖3f可以看出，在低λ（＜2）下的擴(kuò)增時(shí)間較窄，這使得區(qū)分不同占有率（一種、兩種、三種或四種酶）的液滴尖峰成為可能。研究人員驗(yàn)證了活性分布由高斯函數(shù)的和進(jìn)行了令人滿意的擬合，這些高斯函數(shù)各自的權(quán)重受每個(gè)樣本中λ測(cè)量值的泊松頻率的約束。液滴占有率和泊松定律之間的一致性證明了通過數(shù)字分析測(cè)得的低活性分?jǐn)?shù)不是由于酶的非泊松分布（這可能發(fā)生在聚集或結(jié)合到基因組DNA長(zhǎng)片段的酶中）。重要的是，含有單一酶的液滴中的開始時(shí)間分布的變異系數(shù)僅為17%，這表明活性酶池具有相當(dāng)均勻的活性分布。

圖3 通過延時(shí)實(shí)驗(yàn)評(píng)估多肽庫活性分布

為了探索無活性組分的來源，研究人員評(píng)估了在各種應(yīng)激條件下活性分布是如何受到影響的：包括熱休克步驟的物理應(yīng)激或化學(xué)應(yīng)激。對(duì)于第一種情況，觀察到隨著熱休克持續(xù)時(shí)間的增加，酶的活性部分呈指數(shù)衰減。然而，殘留活性級(jí)分內(nèi)的活性分布與未處理樣品非常相似。無論熱激溫度如何，都可以觀察到這種兩種狀態(tài)的行為，其中酶要么完全活性，要么完全失活。它與先前報(bào)告中描述的災(zāi)難性變性模型的概念相一致，在該模型中，加熱的酶經(jīng)歷可逆的構(gòu)象變化，直到達(dá)到臨界點(diǎn)并不可逆地展開。

相反，在氧化處理過程中出現(xiàn)了一種明顯的模式：隨著H?O?濃度的增加，活性酶的比例再次下降；然而，開始時(shí)間的分布明顯偏離了未經(jīng)處理的樣品：當(dāng)氧化應(yīng)激增強(qiáng)時(shí)，更多的單一酶表現(xiàn)出較低但可測(cè)量的活性。因此，輕度氧化應(yīng)激導(dǎo)致一部分無活性的酶和一群具有中等活性的酶，這表明了一種機(jī)制，即活性降低的氧化底物在活性完全喪失之前是可接近的?；钚晕稽c(diǎn)外殘基側(cè)鏈的氧化可能會(huì)使催化袋不穩(wěn)定，影響底物識(shí)別或降低支架的穩(wěn)定性。在未處理的商業(yè)樣品中沒有觀察到這種拓寬的活性分布，表明它們包含的全長(zhǎng)多肽的無活性部分可能與折疊/聚集問題有關(guān)，而不是與化學(xué)損傷有關(guān)。

圖4 酶群體的功能異質(zhì)性研究

綜上所述，研究人員通過將指數(shù)分子放大器的靈敏度與DNA酶電路和液滴讀數(shù)的模塊化相結(jié)合，可以在單分子水平上特異性地檢測(cè)幾乎所有與 D(R)NA相關(guān)的酶活性。這種被稱為數(shù)字PUMA（可編程超靈敏分子放大器）的策略已在十多種不同的酶中得到驗(yàn)證，其中包括許多催化速率較慢的酶，甚至達(dá)到了化膿性鏈球菌Cas9表觀單次周轉(zhuǎn)的極限。數(shù)字計(jì)數(shù)法能獨(dú)特地獲得絕對(duì)摩爾定量，并能在所有測(cè)試的商業(yè)制劑中發(fā)現(xiàn)大量非活性催化劑。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單個(gè)酶分子的放大反應(yīng)，研究人員還提取了催化劑群體的活性分布，揭示了各種壓力下的其他失活途徑。該方法極大地?cái)U(kuò)展了可受益于單分子分辨率量化和功能分析的酶的數(shù)量。因此，數(shù)字PUMA 有望成為診斷或生物技術(shù)應(yīng)用中精確酶定量的多功能框架。此外，這種數(shù)字測(cè)定方法還可用于研究蛋白質(zhì)功能異質(zhì)性的起源。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41565-024-01617-1